دریافت قیمتها در تلگرام

دریافت قیمتها در تلگرام

فائو یا سازمان خواربار و کشاورزی ملل متحد

بورس جهانی شیکاگو

بورس جهانی شیکاگو

فید ماشین

طیوران ابزار

افرند توسکا

سیانس

 آنفلوآنزای طیور
آنفولانزای طیور  

این توصیه ها فقط هنگامی که بیماری شدید باشد و کنترل آن مشکل می باشد مورد نیاز هستند .
گرفتن نمونه های خون وتنفسی بطور مرتب برای چک کردن عفونتهای باکتریایی احتمالی مورد نیاز می باشد . استفاده از درمان آنتی بیوتیکی به صورت تزریقی را نیز باید در نظر داشت . از آمانتیدین یا ریمانتیدین استفاده نکنید بدلیل خطر افزایش موتاسیون انتخابی در جهت مقاومت ویروسی با توانایی جهانی شدن . نتایج اولیه که توسط مراکز مختلف بهداشت جهانی بدست آمده پیشنهاد می کند که ویروس آنفولانزای A (H5N1) که اخیراُ از انسانها جدا شده اند نسبت به آمانتیدین وریمانتیدین مقاوم می باشند .
پرهیز از تجویز سالیسیلاتها (مانند آسپیرین) در بچه های زیر 18سال بدلیل ریسک سندرم reye .
استفاده از paracetamol یا ibuprofen با هم بصورت خوراکی یا شیافت برای کنترل تب.
تعدیل کنندهای سیستم ایمنی مانند کورتیکواستروئیدها بایستی بیماری آنفولانزای طیور (قسمت اول)
تاریخچه :
این بیماری که سبب مرگ ومیر بالایی در پرندگان عفونی می شود (7) برای اولین بار در سال 1878 ،بیش از صد سال پیش در ایتالیا شناخته شد (1) . تا اوائل سال 1901 نشان داده شد که میکروارگانیسم عامل این بیماری یک ویروس می باشد اما هنوز تا سال 1955 ارتباط بین این بیماری و دیگر ویروسهای ملایم جدا شده از پرندگان با ویروسهای آنفولانزایA پستانداران مشخص نشده بود(برای اولین باردردهه930 ) .(7)
آنفولانزای مرغی در ایالت متحده در سال 25 ـ 1924 شایع شد و در سال 1929 دوباره این شیوع رخ داد در حالی که هر دوبار ریشه کن شد .(1)
یک پاندمی بزرگ از آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن در شمال شرقی ایالت متحده در سال 84 ـ 1983 رخ داد . بیش از دو سال وقت و70 میلیون دلار هزینه برای ریشه کنی آن صرف گردید و بطور تخمینی 17میلیون پرنده طی برنامه ریشه کنی معدوم شدند .(1)
فقط ویروسهای آنفولانزای تیپ A بعنوان عوامل طبیعی عفونت زائی در پرندگان شناخته شده بودند در حالی که 9 تحت تیپ NA و15 تحت تیپ HA از آنفولانزای تیپA که به احتمال خیلی زیاد به صورت ترکیبی با هم می باشند از گونه های مختلف پرندگان جدا شده اند . (7 )
ایالت متحده هیچ شیوع وسیعی از سال 1986 نداشته است اگر چه سویه های کم پاتوژن در حال حاضر وجود دارند وخسارات قابل توجه ای نیزبه بارمی آوردند.(1 )
در سال 97 ـ 1996 تعدادی از مزرعه های تخم گذار در مناطق لبانون و لنکستر تیتر PA آنها برای آنفولانزای مرغی H7N2 مثبت شد . این سویه برای جوجه ها غیر بیماری زا بود ولی دارای اثرات وسیع مخرب برروی صنعت طیور بود . (1 )
در سال 1994 یک شیوع آنفولانزای مرغی در مکزیک رخ داد که به صورت ملایم و خفیف شروع شد اما در اثر موتاسیون به یک ویروس کشنده تبدیل شد وسبب تلفات سنگینی در گله طیور گوشتی گشت . (1 )
یک سناریوی مشابه در شمال شرقی ایالت متحده در اواسط 1980 رخ داد .(1 )
سرو تایپ بسیار پاتوژنی که سبب شیوع در سالهای 84 ـ 1983 در ایالت متحده و مکزیک گردید H5N2 نام داشت . (1 )
از نظر تاریخی ، سروتایپهای H5 و H7 با بیماری های با حدت بالا در طیور همراه هستند . (1 )
پرندگان وحشی :
اولین جداسازی ویروس آنفولانزاازپرندگان شکاری درسال1961 از پرستوهای معمولی (stema hirundo)
در جنوب آفریقا صورت گرفت ، اما تا اواسط دهه1970 هیچ گونه تحقیق سیستماتیکی برروی آنفولانزا در پرندگان شکاری انجام نگرفت بود . شواهد نشان می دهند که مخازن مهم ویروسهای آنفولانزا پرندگان شکاری می باشند و ویروس می تواند در این جمعیت ها پایدار بماند . (7 )
پرندگان قفسی :
از سال 1975 زمانی که اولین جداسازی از پرندگان قفسی به ثبت رسید مشخص شد که تمامی نمونه های جداشده از پرندگان قفسی بطور عمده از تحت تیپ H3 و H4
می باشند . ویروسهای آنفولانزای مرغی بطور عمده از گونه های گنجشکیان جدا
می شوند و به ندرت گونه های طوطی سانان (psittacin) را درگیر می سازند . (7 )
گر چه در صورت وجود ویروسهای آنفولانزا در پرندگان یک منطقه موقع خروج آن از کشور حتی تا سالها بعد ازجدا نشدن ویروس ازآن منطقه پرندگان رادرقرنطینه برای مدت دوره کمون تحت مراقبت نگه می دارند.(7 )

مثالهای تائیدشده ای از عفونت های انسانی با ویروسهای آنفولانزا از سال 1997:
1997 : در هنگ کنگ ، آنفولانزای مرغی تیپA (H5N1) هم جوجه ها هم انسانها را عفونی ساخت ، این اولین باری بود که ویروس آنفولانزای مرغی مستقیماُ از پرندگان به انسان منتقل می شد .
طی این شیوع 18 نفر بستری شدند و 6 نفر از آنها از بین رفتند . برای کنترل شیوع مسئولین تقریباُ 5/1 میلیون جوجه را از بین بردند برای اینکه مخزن ویروس را از بین ببرند. دانشمندان نشان دادند که ویروس ها ابتدا از طریق پرندگان در میان انسانها شایع شدند وانتقال شخص به شخص کمتر مورد توجه می باشد . (1 )
احتمال پاندمیک شدن یک آنفولانزای مرغی :
تمامی ویروسهای آنفولانزا توانایی تغییر را به طور بالقوه دارا می باشند . این مسئله احتمال دارد که ویروس آنفولانزای مرغی تغییر پیدا کند و توانایی آلوده ساختن انسان را پیدا کند و براحتی از شخص به شخص منتقل شود . بدلیل اینکه این ویروسها به طور معمول انسانها را عفونی نمی سازند باعث شده که در میان جمعیت انسانی هیچ مصونیتی یا به میزان خیلی کمی مصونیت در برابر آنها وجود داشته باشد . اگر یک ویروس آنفولانزای مرغی قادر باشد انسانها را آلوده سازد وبراحتی از شخص به شخص منتقل شود یک پاندمی آنفولانزا می تواند پیش آید . پاندمی های گذشته آنفولانزا سبب مرگ ومیر وخسارات اقتصادی بالایی شده اند .
در قرن بیستم 3 پاندمی رخ داده است :
1-1919 ـ 1918 : آنفولانزای اسپانیایی : A(H1N1) ، سبب بالاترین مرگ ومیر شده بیش از 500000 نفر در ایالت متحده و 20 تا 50 میلیون نفر احتمالاُ در تمام دنیا از بین رفتند . تعداد زیادی در همان روز اول بعد از عفونت وبقیه از عوارضی که خیلی زود ظاهر می شدند در گذشتند . تقریباُ نیمی از آنها جوان و بالغین سالم بودند .
2-1958 ـ1957 : آنفولانزای آسیایی : A(H2N2) سبب حدود 70000 مرگ ومیر در ایالت متحده شده است . اولین بار در کشور چین در اواخر فوریه 1957 شناسایی شد وآنفولانزای آسیایی تا ژوئن 1957 در ایالت متحده منتشر شد .
3-1969 ـ 1968 : آنفولانزای هنگ کنگی : A(H3N3) سبب به طور تخمینی 34000 مورد مرگ ومیر در ایالت متحده گردید . این ویروس اولین بار در هنگ کنگ در اوائل 1968 شناسایی شد وتا اواخر سال به ایالت متحده سرایت کرد . تیپ A(H3N3) هنوز تا امروز نیز در چرخش است . وقتی که یک پاندمی آنفولانزای ویروسی پدید می آید آن ویروس در میان جمعیت های انسانی مستقر می گردد و برای سالها به چرخه زندگی خود ادامه می دهد . مرکز کنترل بیماری های US و سازمان بهداشت جهانی دارای برنامه های وسیعی برای نشان دادن میزان فعالیت آنفولانزا در تمام دنیا می باشند که شامل رسیدگی سریع به سویه های ویروسی که احتمال پاندمیک شدن آنها وجود دارد می باشد .
دیگر مثالهای تائید شده از عفونت آنفولانزای مرغی در انسانها :
1999 : در هنگ کنگ ، مواردی از آنفولانزای مرغی A تیپ (H9N2) در دو کودک تائید شد که هر دو بیمار بهبود یافتند و موارد دیگری تائید نشد . شواهد دال بر این است که طیور منبع عفونت بودند و راه اصلی انتقال از پرنده به انسان بوده است . اما احتمال انتقال فرد به فرد نیز هنوز باقی می ماند . موارد دیگری از عفونت با H9N2 از mailand چین در طول سالهای 1998 تا 1999 گزارش شد . (1 )
2003: آنفولانزای مرغی تیپ A (H7N7) در میان کارگران مرغداری وخانواده هایشان در نیدرلند طی شیوع آنفولانزا در مرغداری ها شایع شده بیش از 80 مورد بیماری گزارش گردید ، (علائم به صورت عفونت چشمی به همراه علائم تنفسی بود) و یک بیمار از بین رفت . شواهدی نیز ازانتقال فرد به فرد وجود داشت . (1 )
2003 : عفونتH9N2 در یک کودک در هنگ کنگ تائید گردید . کودک بستری شد اما بهبود یافت . (1‌ )
همچنین ویروسهای آنفولانزا که مسئول پاندمیک های 1957 و 1968 بودند بوسیله نوترکیبی ژنتیکی بین انسان و ویروسهای مرغی پدید آمدند .
همزمان با اولین گزارش انتقال داخل گونه ای ویروسهای خوکی به انسان در سال 1974 ، موارد اسپورادیک آن از انسان جدا شد و بیشترین میزان عفونت در سربازان عفونی در اپیدمی fort dix در ایالت متحده در سال 1976 گزارش شد . (4 )
متعاقباُ ، ویروسهای نوترکیب آنفولانزای خوکی به نام ویروس آنفولانزای مرغی ـ انسانی A H3N2 نشان داده شد که مسئول دو مورد آنفولانزا در بچه های کم سن و سال در netherland در سال 1993 بود . این ویروسهای نوترکیب دارای ژنهای شبه مرغی بودند که پروتئین های داخلی را کد می کردند و ژنهای شبه انسانی HA و NA را داشتند .
مقدمه :
ویروسهای تیپ A آنفولانزا می توانند تعدادی از رده های حیوانی را شامل : پرندگان، خوکها ، اسبها ، فک و والها را عفونی سازند . ویروسهای آنفولانزائی که پرندگان راعفونی می سازند ویروسهای آنفولانزای مرغی نامیده می شوند.پرندگان بخصوص دارای اهمیت ویژه ای هستند به دلیل اینکه تمامی تحت تیپهای آنفولانزایA در میان پرندگان وحشی که میزبانهای طبیعی و با اهمیت و مورد توجه این ویروسها
می باشند در چرخه اند . آنفولانزای مرغی بطور معمول مستقیماُ انسانها را عفونی
نمی سازند یا اینکه دارای چرخه زندگی در میان انسانها نمی باشند . (1 )
آنها را می توان بر اساس قدرت بیماریزائیشان به دو گروه مجزا دسته بندی کرد . ویروسهای بسیارپاتوژن مسبب طاعون پرندگان که امروزه بخش ویروسهای آنفولانزای بسیار پاتوژن را تشکیل می دهند (HPAT) که در آن میزان مرگ ومیر ممکن است تا 100% برسد . این ویروسها به تحت تیپهای H5 و H7 محدود می شوند اگر چه تمامی ویروسهای این تحت تیپها سبب HPAI نمی شوند . تمام ویروسهای باقی مانده باعث بروز بیماری ملایم و ابتدائی تنفسی می شوند که ممکن است بوسیله دیگر عفونتها یا وضعیت های محیطی تشدید گردد .(7 )
ویروسهای آنفولانزا تیپ A بر اساس پروتئین های سطحی شان یعنی هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) تقسیم بندی می شوند . تعداد 15 تا تحت تیپ HA و 9 تا تحت تیپ NA وجود دارد . تمامی گروهها می توانند در پرندگان یافت شوند ولی فقط 3 زیرگروه از HA ) H1وH2 وH3 ( و دو زیر گروه از NA (N1 N2) دارای چرخه زندگی در میان انسانها هستند . (1 )
آنفولانزای مرغی معمولاُ پرندگان وحشی را بیمار نمی سازد ولی می تواند پرندگان اهلی را شدیداُ بیمار ساخته وآنها را بکشد . بطور معمول انسانها را عفونی نمی سازند لیکن تعدادی از مثالهای عفونتهای انسانی و شیوع در میان آنها از سال 1997 گزارش شده است .
هنگامی که چنین عفونتهایی رخ می دهد مسئولین بهداشت جهانی نشان داده اند که وضعیت و نشانه های بالینی بیماری به آنفولانزای مرغی نزدیک می باشد و این می تواند بطور بالقوه باعث انتشار وسیع عفونت در میان انسانها گردد .(1 )
امروزه قوانین وسیع حفظ امنیت زیستی از انتشار ویروس به ایالت متحده و کشورهای همسایه جلوگیری می کند . تلاشهای محققان مستقیماُ برروی اینکه چگونه و چرا ویروسهای پاتوژن تبدیل به ویروسهای بسیار پاتوژن و خطرناک می شوند متمرکز می باشد .(1 )
این ویروسها دارای RNA ,envelop تک رشته ای منفی که به تایپهای A وB وC طبقه بندی می شوند هستند.(4)
ژنوم ویروس آنفولانزای A شامل 8قطعه RNA تک رشته ای می باشد که حداقل 10محصول ژنی راکد می کند .
ماهیت سگمنته ژنوم باعث نوترکیبی ژنها هنگامی که سویه های مختلف یک میزبان راعفونی می سازد می شود.
نوترکیبی ژنتیکی ، که منجر به تولید تغییرات آنتی ژنیک در انسانها می شود به عنوان شیفت آنتی ژنیک شناخته می شود . تعدادی از چنین شیفتهای آنتی ژنی تاکنون رخ داده است . برای مثال ، پاندمی وخیم آنفولانزا در 1918 و 1920 بدنبال خود شروع یک عفونت ویروسی در انسانها را با یک ویروس شبه مرغی به نام H1N1 به همراه داشت و مثالهای دیگر که در تاریخچه ذکر شده است .(4 )
انتقال ویروسهای کاملاُ مرغی بطور مستقیم ، بدون هیچ میزبان واسطی مانند خوک تصور می شود که بوسیله رسپتورهای اختصاصی سلولهای انسانی تعیین گردد . لیکن ، عفونت انسانها با ویروسهای آنفولانزای A مرغی امروزه مستند و ثابت شده است .(4)
مثلاُ تمامی 8 قطعه ژنوم ویروس H5N1 جدا شده از انسانها در سال 1997 منشا مرغی داشتند و 8 قطعه ژنوم H9N2 جدا شده در سال 1999 نیز مرغی بودند که 6 قطعه ژنی آن که ترکیبات داخلی را کد می کردند مشابه آنهایی بودند که در سال 1997 در ویروس H5N1 جدا شده از انسان و مرغ مشاهده شده بودند .(4)
اگر چه این گونه انتقال های بین گونه ای غیر معمول می باشد اما کاملاُ مشخص شده که برای شناسایی زود بهنگام میکروارگانیسم مسئول بیماری ضروری می باشد . تشخیص سریع و تعیین خصوصیت ویروسهای آنفولانزا برای مقایسه واریانتهای جدید با سویه هایی که اخیراُ در چرخش می باشند و نیز با سویه های واکسن ضروری می باشد . (4)
برای این هدف ، ویروسهای آنفولانزایی که در آزمایشگاههای تشخیصی جدا
می شوند بطور روتین برای بررسی ژنتیکی و آنتی ژنیکی به آزمایشگاه رفرنس فرستاده می شوند . (4)
گلیکوپروتئین هماگلوتینین ویروس آنفولانزا بعنوان یک پیش ساز تولید می شود (HAO) که نیاز به شکستن بعد از ترجمه توسط پروته آزهای میزبان جهت فعال شدنش دارد . پروتئین های HAO پیش ساز دسته کم پاتوژن آنفولانزای مرغی دارای یک اسید آمینه آرژنین در محل برش می باشند و فقط توسط پروته آزهای میزبان مانند آنزیم شبه تریپسین محدود می شوند بنابراین به همانند سازی در محل هایی از بدن که این آنزیمها یافت می شوند محدود میگردد ، مثل دستگاه تنفسی و روده ای . ویروسهای HPAI دارای اساس چند آمینواسیدی (آرژنین و لیزین ) در محلهای برش HAO هستند و بوسیله آنزیم منحصر بفرد پروته آزی این ویروسها قادر هستند در میان پرندگان همانند سازی کنند به ارگانهای حیاتی و بافتها آسیب برسانند که منجر به بیماری و مرگ می شوند . (7)
مشخصات آنفولانزای مرغی در پرندگان :
بطور عمده پرندگان آبزی بعنوان میزبانهای اصلی این ویروسها را در روده و ترشحات آن دارا می باشند . طیور آلوده ویروس را از طریق بزاق ، ترشحات بینی و مدفوعشان دفع ژمی کنند . آنفولانزای مرغی در میان پرندگان مستعد هنگامی که آنها با ترشحات پرندگان آلوده تماس پیدا می کنند منتشر می شود اما در هر حال انتقال دهانی ـ مدفوعی شایع ترین مدل انتشار می باشد .
بیشتر ویروسهای آنفولانزا باعث بروز علائمی در پرندگان وحشی نمی شود یا اینکه فقط علائم خفیفی ایجاد می کنند . البته میزان بروز علائم درانواع پرندگان بسیار متفاوت می باشد وبستگی به سویه ویروس و نوع پرنده دارد. عفونت با ویروسهای اصلی آنفولانزای A ( برای مثال تعدادی از سویه های H5 وH7 ) می تواند باعث شیوع گسترده بیماری ومرگ ومیر در میان تعدادی از پرندگان وحشی و بخصوص پرندگان اهلی مانند جوجه ها و بوقلمون می شود.
علائم آنفولانزای مرغی در انسان :
علائم گزارش شده دارای طیفی از علائم آنفولانزای تیپیک (برای مثال تب ، سرفه ، گلودرد ودرد ماهیچه ) تا علائم چشمی ، پنومونیا ، اختلالات حاد تنفسی ، پنومونیا ویروسی ، و دیگر عوارض تهدید کننده سلامت می باشد . (1)
انتقال :
پرنده آلوده ویروس را در مدفوع و ترشحات مجرای بینی دفع می کند . تصور
می شود که گله های بهبود یافته نیز ویروس را البته به میزان کمتری نسبت به گله های با بیماری حاد دفع کنند .
مرغ های وحشی واهلی جزء اولین مخازن ویروسهای آنفولانزا هستند . مرغابی وحشی معمولاُ علائم کلینیکی را نشان نمی دهد ولی می تواند برای مدت طولانی ویروس را حمل کند . بعلاوه ، مرغابی می تواند با بیش ازیک نوع ویروس عفونی گردد . تعیین تایپها با این مشکل همراه است که آنتی بادی قابل جداسازی در خون این پرندگان بعد از در معرض قرار گرفتن یافت نمی گردد . ویروس آنفولانزای موجود در آب و مواد معدنی ,آلی ، دریاچه ها و استخرها توسط مرغابی های عفونی دوباره وارد چرخه می شود . مخلوط شدن این پرندگان با مرغابی های پرورشی یکی از فاکتورهای دخیل در بروز تعدادی از همه گیری ها می باشد .
ویروس آنفولانزای مرغی می تواند برای مدتهای طولانی در دماهای معتدل زنده باقی بماند. ودر موارد فریز شده نیز برای مدت نامحدود زنده باقی می ماند .
بنابراین بیماری می تواند از طریق دفع غلط اجساد وکود ویا دیگر محصولات طیور منتشر گردد .
همچنین این بیماری می تواند براحتی توسط مردم و وسایل آلوده به ویروس آنفولانزا منتشر گردد . این ویروس می تواند برروی کفش های آلوده ، لباسها ، صندوق ، کارتن های تخم مرغ ، حاملین ودیگر تجهیزات انتقال پیدا کند.تمام محل های مزرعه طیور آلوده بایستی مورد توجه قرار گیرند وبطور کامل تمیز وضد عفونی شوند ، قبل از اینکه مجوز انتقال به آنها داده شود لباسهایی که در مزرعه آلوده پوشیده شده باید حتماُ شسته شوند .
حشرات وجوندگان ممکن است بطور مکانیکی ویروس را از پرندگان آلوده به پرندگان مستعد حمل کنند . ویروس آنفولانزای مرغی از تخم های اردک جدا شده است و این مسئله احتمال انتقال عمودی یا vertical را مطرح می سازد اگرچه بطورتیپیک ویروس جنین تخم مرغ رامی کشد . شواهد کم و ناچیزی ازعفونت جوجه با منشاتخم در دست می باشد . ولی سطح پوسته تخم مرغها می تواند با ویروس آلوده شود در نتیجه یک راه انتقال محسوب می شود .
ویروس آنفولانزای مرغی بکرات از پرندگان وارداتی سالم جداشده است . این پرندگان آلوده یک خطر بالقوه برای پرندگان قفسی ، وحشی و گله های طیور پرورشی محسوب می شوند . مغازه های فروش پرندگان زنده یک مخزن عفونت می باشند . این مغازه ها اغلب انواع پرندگان خانگی و زینتی را می فروشند و به ندرت این محل ها تمیز یا ضد عفونی می شوند . (1)
این سیستم که انواع مختلف طیور استرس دیده را با هم مخلوط می سازد یک عامل کلیدی در شیوع آنفولانزا در تجارت طیور می باشد .
صاحبان مرغداریها خود اولین خط دفاعی برای شناسایی شیوع آنفولانزای مرغی هستند . اگر پرندگان در نشان دادن علائم آنفولانزای مرغی پیشرفت کردند بایستی بلافاصله به سازمانهای مسئول اطلاع دهند . (1)
پیشگیری :
برنامه واکسیناسیون ، مراقبت سخت در طول مدت دوره چهل روزه پرورش طیور برای کنترل فرمهای خفیف بیماری در گله های مرغی و اردکها مورد استفاده قرار
می گیرد . اما در مورد بیماری های کشنده تر مراقبت سخت درطول دوره وجداسازی جوجه های آلوده تنها روش موثر در متوقف کردن آنفولانزای مرغی می باشد.
موفقیت در چنین برنامه هایی بستگی به همکاری کامل و حمایت دولت از صنعت طیور دارد .
با شناخت این مسئله که مخزن آنفولانزای مرغی مرغابی های وحشی می باشند هر کوششی باید بر اساس جلوگیری از تماس مستقیم و غیرمستقیم بین پرندگان خانگی و
مرغابی های وحشی طرح ریزی گردد .(2)
WHO (سازمان بهداشت جهانی) و مدیریت عفونتهای انسانی از طریق کنترل آنفولانزای A(H5N1)
این راهنمایی ها بر اساس اطلاعات موجود از عفونتهای آنفولانزای انسانی A (H5N1) که از تجربیات بدست آمده از شیوع 1997 در هنگ کنگ یک منطقه اختصاصی اداری از چین و از گزارشات اولیه از موارد اخیر در تایلند و ویتنام استخراج شده است . همانطور که اطلاعات بیشتر بدست می آید این راهنمایی ها نیز بطور مناسب تغییر پیدا می کند .(2)

توجه :
مفهوم اولیه کنترل عفونت رعایت احتیاط برای به حداقل رساندن انتشار تنفسی بیماری می باشد .
مدیریت مناسب برای پیشگیری از بیماری حاد ومرگ ومیر
شناسایی زود هنگام و دنبال کردن افرادی که در رسیک ابتلاء هستند . به منظور درمان آنها با داروهای ضد ویروسی برای کاهش میزان مرگ ومیرو انتشار بعدی بیماری .
هشدارهای عمومی :
کنترل عفونت موجود شامل به کار بردن احتیاط های استاندارد برای تمام بیمارانی که به بیمارستان مراجعه می کنند می باشد .
اگر که تشخیص آنفولانزای A (H5N1) بر اساس علائم بالینی داده شود بایستی احتیاطهای اضافی تا موقعی که تشخیص رد شود رعایت گردد .
در آن کشور ها وسرزمین هایی که ویروس های آنفولانزای A(H5N1) بعنوان یک عامل بیماری زائی در جمعیت های حیوانی شناسایی شده است ، تشخیص آنفولانزای H5N1 بایستی با دیگر بیماریهای حاد تنفسی تمایز داده شود . اشخاصی که هم با طیور بیمار وهم با طیوری که از بیماری تلف شده اند در تماس هستند در معرض ریسک ابتلای بیشتری هستند .
کشور ها یا سرزمین هایی که بطور تجربی با شیوع آنفولانزای مرغی با بیماریزایی بالا مواجه هستند بایستی افرادی که در بخش بهداشت و پزشکی کار می کنند با واکسن فصلی نو ترکیب سازمان بهداشت جهانی واکسینه شوند . بطور منطقی این موضوع سبب کاهش فرصت ایجاد عفونت در انسانها توسط ویروس آنفولانزای مرغی می شود ولی درعوض،فرصتی را برای بازآرائی وظهورآنفولانزای جدید با قدرت جهانی شدن پدید
می آورد.(3)
- کنترل عفونت و پیشگیری از انتشار تنفسی آنفولانزای :A (H5N1)
انتقال آنفولانزای انسانی بوسیله قطرات و ذرات منتشر در هوا صورت می گیرد . انتقال توسط تماس مستقیم و غیر مستقیم نیز شناسایی گردیده است . لیکن در طول سال 1997 آنفولانزای A (H5N1) در انسانهادر SAR هنگ کنگ ، رعایت احتیاط های مربوط به انتشار قطرات و تماس مستقیم بطور موفقیت آمیز از انتشار بیماری جلوگیری کرد .
بدلیل درصد بالای مرگ ومیر بیماری و احتمال موتاسیون ویروس که باعث انتقال فرد به فرد شود سازمان بهداشت جهانی استفاده از ماسکهای بسیار موثر به منظور رعایت احتیاط هنگام تماس و برخورد با قطرات معلق توصیه کرد . بعلاوه اگر که یک اطاق با فشار منفی در دسترس باشد بهتر می باشد . (3)
ایزوله کردن بیمار در یک اتاق ، اگر که یک اتاق جداگانه در دسترس نباشد بیماران بایستی به طور جداگانه در یک بخش یا اتاق مجزا بستری شوند . تختها بایستی یک متر با هم فاصله داشته باشد و بهتر است که تختها بوسیله یک سد فیزیکی مثل پارتیشن از هم مجزا گردند .
مناسبترین روش برای محافظت اشخاصی که وارد اتاق می شوند استفاده ازگان ، ماسکهای بسیار قوی ، محافظ صورت یا عینک و دستکش می باشد . تعدادمحدودی از کارکنان سازمان بهداشت جهانی (HCW) که دارای تماس مستقیم با بیماران بودند نبایستی با بیماران دیگر برخورد کنند . (3)
تعداد دیگری از کارمندان بیمارستان (مانند نظافت چی ها و پرسنل آزمایشگاه) که با محیط این بیماران در تماس هستند همچنین بایستی محدود گردند .
بایستی از HCW ها (پرسنل بیمارستان ) که در تماس با بیماران هستند خواسته شود که روزانه دوبار دمای بدنشان راچک کنند وهرگونه تبی را به مسئولین بیمارستان گزارش دهند . یک HCW که دارای تب بالای 37c است و در تماس مستقیم با بیماران بوده است بلافاصله بایستی درمان شود .
راهکارهای پیشگیرانه بعد از در معرض قرار گرفتن (برای مثال: داروهای خوراکی oseltamivir به میزان روزانه 7mg برای 7روز) برای پرسنل بیمارستانی که احتمال تماس با ترشحات افراد بیمار برایشان وجود دارد توصیه می شود HCW هایی که حال عمومی خوبی ندارند نبایستی با بیماران در تماس مستقیم باشند چرا که آنها آسیب پذیر هستند و ممکن است که وقتی که در معرض ویروس H5N1 قرار گیرند بیماری حاد تری را روی کاربیاورند .(3)

بیماری آنفولانزای طیور (قسمت دوم) مدیریت بیماران :
گرفتن نمونه خون ودستگاه تنفس و ارسال به آزمایشگاه برای تست آنفولانزا و دیگر عفونتهایی که علائم بالینی مشترک دارند .
درمان با اینهیبیتور نورآمینیدازها مانند oseltamivir (بصورت 75mg خوراکی ، دوبار در روز) بعنوان اولین مراحل درمان بکار میرود .
اگر که علائم بالینی ظاهرشد بیمار بایستی در بخشی که قبلاُ توضیح داده شد برای کنترل عفونت بستری گردد.
اگر که تشخیص داده شد بیمار نیاز به بستری شدن ندارد بایستی به بیمار وخانواده اش ضوابط بهداشت فردی و کنترل عفونت (برای مثال: شستن دستها، استفاده از ماسک کاغذی یا جراحی برای شخص بیمار وپرهیز از تماس جمعی) آموزش داده شود اگر که نیاز دارد توسط دارو تحت درمان حمایتی قرار گیرد همچنین بیمار با پزشک معالج توسط تلفن ویا ویزیت شدن در تماس باشد .درمانهای حمایتی شامل مراقبت از اشباع بودن اکسیژن واستفاده از ذخیره اکسیژن در صورت کم شدن اکسیژن ماسکهای اکسیژن nebulizer ویا high-air-flowدر سندرم عفونت حاد تنفسی برای پیشگیری از انتشار تنفسی بکار می رود .
فقط به موازات عملیات کلینیکی صورت گیرد. پاسخ ایمنی انسان در مقابل آنفولانزای A (H5N1) هنوز نیاز به مطالعات بیشتری دارد .(3)
 
  از ribavirin استفاده نکنید. هیچگونه شواهدی دال بر موثر بودن این دارو بر علیه آنفولانزا وجود ندارد در عوض عوارض ناخواسته مانند آنمی شایع می باشد و ممکن است که بیمار را بیشتر به مخاطره بیاندازد .
برای فهم بهتر الگوی دفع ویروس در انسانهای عفونی شده با ویروسها A (H5N1) در شیوع آنفولانزا در تایلند وویتنام نیاز به مطالعات بیشتری می باشد . تا اینکه شواهد دیگری به دست آید در حال حاضر WHO توصیه کرده است که ضوابط کنترل عفونت تا 7روز بعد از قطع تب ادامه پیدا کند .
مطالعات قبلی برروی آنفولانزا براین امر که کودکان باسن کمتراز 12سال می توانند برای 21روز پس از شروع بیماری ویروس را دفع کنند می باشد . بنابراین ، برای کنترل عفونت بهتر است که کودکان برای این دوره در محل مراقبت باقی بمانند . کودکان در این مدت نبایستی به مدرسه بروند .
افرادی که بااین بیماران در تماس مستقیم بوده اند بلیستی برای 7روز تحت نظر قرار گرفته شوند ودمای بدن آنها دوبار در روز چک شود اگر که فردی تب بالاتر از 38c و سرفه یا تنگی نفس را نشان داد بایستی بلافاصله درمان شود .(3)
آنفولانزای مرغی جدید در دانمارک،10000 اردک را ازبین برد .
ویروس A H5N1 در اردکها شناسایی شد .
یک نوع جدید ویروس A آنفولانزا ،H5N1 ، برای اولین بار در اردکهای دانمارکی شناسایی شد . بدنبال ظهور بیماری بین 12000 اردک . در یک مزرعه اردک نزدیک به شهر salling در jutland دو ویروس شناسایی شدند: یک ویروس عامل Entritis در اردک (DVE) ،که عامل بیماری بود ویک ویروس آنفولانزای A .
تمامی اردکها بطور خیلی وسیعی در 10 سپتامبر 2003 درگیر بیماری شدند . ویروس آنفولانزایA از بافت تعدادی از اردکها جدا شد . انستیوسرم سازی statens از RT – PCRطول کامل هماگلوتینین ونورآمینیداز با تعیین توالی روتین که ترجیحاُ بطور مستقیم برروی نمونه ها انجام می گیرد تا برروی ویروسهای کشت داده شده استفاده کردند و ژنوتیپ این ویروس را H5N7 نام نهادند .
این تایپ قبلاُ هیچ گاه شناسایی نشده بود وبررسی های بیشتر هم اکنون برروی آن در حال انجام است . نکته با اهمیت اینکه این ویروس در انسانها تشخیص داده نشده بخصوص در میان افرادی که با این اردکها تماس داشتند یا در تعدادی موارد غیر مرتبط ویروس آنفولانزای (H3N2) A در دانمارک از 1 سپتامبر 2003 تشخیص داده شد .12 سویه ویروس آنفولانزای مرغی (AIV) A از پرندگان وحشی در دانمارک از 1996 جدا شد که هیچ کدام از آنها H5 یا H7 نبود .
پرندگان وحشی مخزن طبیعی آنفولانزای مرغی هستند (AIV) . اگر چه ویروسهای کم پاتوژن H5 وH7 وجود دارد ولی تمامی ویروسها با بیماری زایی بالا یا H5 یا H7 هستند . پاتوژنسیته ویروسهای AIV H7 و H5 حداقل تا قسمتی وابسته به توالی آمینو اسیدی در محل برش در HA1/HA2 دارد. چنین توالی های پاتوژنیکی یافت نشدند . بنابراین این سویه AIV در گروه ویروسهای باپاتوژنسیته پائین قرار گرفت . توانایی تغییر پاتوژنسیته مثلاُ طی تکثیر در پرندگان یا نوترکیبی در خوکها ویا انسانها شناسایی نشده است . ویروسهای بسیار پاتوژن AIV از تیپ H5 و N7 اغلب انسانها را درگیر
می سازند . این مسئله در سال 1997 در هنگ کنگ رخ داد (H5N1) که 6 نفر از 18 فرد آلوده شده از بین رفتند ودوباره در سال 2003 که یکی از دو فرد آلوده شده مردند ودر سال 2003 در Netherland سویه H7N7 شایع شد که 1 نفر از هر 80 بیمار از بین رفتند . سازمان بهداشت جهانی تصویب کرد تمامی کشورها کمیته های بین المللی در مورد مدیریت اپیدمی های آنفولانزا تشکیل گردد .
شبکه های آزمایشگاهی نظارتی و روشهای ژنوتایپ کردن بایستی با کارهای این
کمیته های بین المللی هماهنگ شود .(6)
ویروسهای آنفولانزای مرغی عوامل مشترک بین انسان وحیوان می باشند که بعنوان یک خطر مداوم سلامت جمعیت های انسانی وحیوانی را تهدید می کند . طی 6 سال گذشته، عفونت انسانها با ویروسهای آنفولانزای مرغی از 3 تحت تیپ (H5, H7, H9) بکرات تشخیص داده شده است .(8)
ویروس آنفولانزای مرغی H7N7 که سبب آنفولانزای شدید در 225 مزرعه طیور در هلند در سال 2003 شد همراه با عفونت ملتحمه چشم (conjunctivitis) در 347 انسان بود . عفونت با ویروس H7N7 در 87 مورد، مورد تائید قرار گرفت ، یک نفر دامپزشک در اثر عفونت جان سپرد . شواهدی از انتقال فرد به فرد ویروس و ایجاد عفونت درخوکها دردست می باشد . این شیوع بوسیله جداکردن وقرنطینه کردن طیور عفونی کنترل شد . برای جلوگیری از پدید آمدن وانتشار ویروس نوترتیب مرغی ـ انسانی کارگران مرغداریها بوسیله واکسن آنفولانزای انسانی واکسینه شدند وداروی آنتی نورآمینیداز به آنها داده شد .(8)
انتقال آنفولانزای مرغی H5N1 به انسانها در سال 1997 ثابت کرد که این ویروس علی رغم اینکه ترجیح می دهدبارسپتورهای سیالیک اسیدمرغی باند شوند توانایی انتقال به انسان رادارد (برای مثال آنهابایک gal 3 و2 × انتهایی لینک می شوند .)
قبل از 1997، گزارشاتی از عفونتهای انسانی باH7N7 وجود داشت (معمولاُ باعث عفونت ملتحمه می شد) ، اما شواهد محکمی دال بر انتقال مکرر ویروسهای مرغی به انسانها دردست نبود . چگونه ویروسهای آنفولانزای مرغی در ایجاد عفونت در پستانداران به طور تصاعدی قوی تر شده اند؟ (متن در مقاله 8)
مقاله شماره (4) :
ارزیابی تلفیق PCR با MOBILITY هترودوبلکس برای تعیین و تشخیص ویروسهای آنفولانزای A از انواع حیوانات :
خلاصه :
انتقال ویروسهای آنفولانزای A از حیوانات میزبان به انسان ممکن است به پدید آمدن گونه های جدید با همه گیری جهانی شود . تشخیص زود بهنگام چنین وقایعی در ابقاء ویروسهای آنفولانزا در درحه اول اهمیت قرار دارد . برای تشخیص و تعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف حیوانات روش توام RT-PCR و (HMA) heteroduplex mobility طراحی گردید. نشان داده شد که این تغییر پذیری (m) ژن در RT-PCR می تواند حساس شود و برای تعیین ویروسهای آنفولانزای A انسانی و مرغی وخوکی اختصاصی گردد.
قطعات تکثیر شده توسط PCR از ویروسهای انسان ، طیور وخوک از 15 تحت تیپ مختلف،با بین 9/1 و4/21 اختلاف نوکلئوتیدی بوسیله روش HMA تمایز گذاشته شد .
تعیین توالی ampliconها نشان داد که الگوی تغییر پذیری هترودوبلکس بااختلاف توالی ها بین DNA مورد آزمایش ورفرنس مرتبط می باشد . متد تکثیرRT-PCR HMA برای جستجوی سریع نمونه ها با یک پانل رفرنس از منشا ویروسهای انسانی ومرغی وخوکی تشخیص داده شد .
ویروسهای مرغی (A / Hongkong / 1073 / 99) H9N2 که با گونه های انسانی واکنش متقاطع داشتند در مقابل panel رفرنس مورد بررسی قرارگرفتند . مشخص شد که محصولات PCRاین سویه بیشترین شباهت را با سویه (A / Quil /Hongkong / GI / 97 ) H9N2 دارد. بررسی توالی ها نشان داد یک اختلاف 101% نوکلئوتیدیبین قطعات amplicon مربوط به A / Quil /Hongkong / GI / 97 و A / Hongkong / 1073 / 99 وجود دارد . با توجه به نتایج کار ما ، روش RT-PCR HMA یک راه سریع و حساس برای جستجوی ویروسهای آنفولانزای جدیدوغیرمعمول
می باشد.شناسایی ویروسهای آنفولانزا معمولاُ شامل رشد ویروس در کشت بافت یا جنین تخم مرغ ، قبل از بررسی تایپها یا ساب تایپها بوسیله ممانعت از هماگلوتیناسیون (HI) می باشد .
لیکن ، این کارها وقت می برد وشناسایی گونه های منشا ویروس ضروری نمی باشد . به همین دلیل ماروش (RT) – PCR براساس ژن ماتریکس (M) توام با روش هترودوبلکس (HMA) mobility برروی محصولات PCR پایه گذاری کردیم .
پروسه خالص سازی نوکلئیک اسیدهای ویروس باشناسایی توسطHMA24 تا36 ساعت وقت می برد و می توان بطور مستقیم آن را برروی نمونه های کلینیکی انجام شود . روش RT-PCR HMA که در اینجا شرح داده می شود به تشخیص زود به هنگام انتقال داخل گونه ای بین میزبانهای انسانی وحیوانی کمک خواهد کرد .
مواد و روشها :
جداسازی ویروس :
ویروسهای آنفولانزا درحفره های آلانتوئیک جنین تخم مرغ رشد می کند . مایع حاوی مایع آلانتوئیک جداسازی شده ودردمای 70c تا موقع مورد نیاز نگهداری
می شود . ویروسهایی که در این مطالعه استفاده شده اند در جدول شماره 1 لیست
شده اند .
ویروسهای /Taiwan/7310/10 ، A/SW/oms/2899/82 ، A/SW/oms/3633/84، /SW/Scotland/410440/94 ، A/SW/hongkong/168/93 ،A/HK/1774/99 و A/HK/1073/99 بوسیله yipu lin و alan hay موسسه بین المللی تحقیقات پزشکی در mill hill انگلستان فراهم شد .
جدا سازی A/DUCK/singapor q/f 119-3/97 بوسیله آزمایشگاه دامپزشکی منشعب از مرکز دامپزشکی سنگاپور انجام گرفت .
ویروس تایپنگ : ویروسهای آنفولانزا که تایپ می شوند با استفاده از آنتی سرم موش خرما همانطوری که قبلاُ شرح داده شد انجام می شد . تمام تستهای HI با استفاده از HAU 8 از ویروسها و 5% سلولهای قرمز (vol/vol) turkey انجام گرفت .
سنتز cDNA وخالص سازی نوکلئیک اسید :
RNA ویروسی از یک میزان 150mg از نمونه بوسیله روش باند شدن با گوآنیدینوم تیوسیانات باسیلیکا همانطوری که قبلاُشرح داده شد انجام گرفت . rna ویروسی در 30 از نوکئازها وآب آزاد حل می شود .
RT از RNA به CDNA بوسیله اضافه کردن 2/22 از RNA به 8/17 مخلوط RT حاوی 20Mm Tris-Hcl (PH=8/4) ، 50 Mm ، KCL و 7/5 Mm ، mgcl2 و 3Mm از هر داکسی نوکلئوتید تری فسفات و 25ng از پرایمرهای راندم (pdn6) و 1/6 u از rnasine و2007 از revers transcriptase ویروس لوسمی موشی (moloney) انجام
می شود .
این مخلوط در دمای 20c برای 10 دقیقه انکوبیت می شود وسپس در 37c برای 45 دقیقه نگهداری می گردد . سپس نمونه ها برای 65 دقیقه تا 100c حرارت می بینند وبعد روی یخ گذاشته می شوند .
مواد اصلی PCR : توالی های پرایمر بدنبال بررسی نواحی حفاظت شده از ژن m مربوط به ویروسهای آنفولانزای A بدست آمدند.خصوصیات پرایمرها بانرم افزار oligo primer analysis بررسی می شوند .جفت پرایمری که در مایه RT- PCR مربوط به m gene مورد استفاده قرار می گیرددر جدول شماره 2 آمده است.
پرامر خارجی ،amp71f قبلاُ برای استفاده در یک مایه pcr برای تعیین ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده است . هر جفت پرایمر در مجاورت مقدار مشخصی از mgcl2 ، نمک و PH انجام می گیرد. برای PCR اولیه، 20 L از cdna به 80 L مخلوط PCR حاوی 8 L از بافر 10XPCR ((PH : 8/4) tris- hcl , 200Mm و kcl 500ml ) و2/4 l از mgcl2 50mm و 1 l ازهرپرایمر خارجی در l (amp 71f ,amp831r ) 5 pmol/
و 6/7/3 l از نوکلئاز – آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز استفاده می شود .
دمای اپیتیم برای چسبیدن برای جفت پرایمروحالت چرخشی بااستفاده از یک mastercycler Gradient thermalcyler تعیین می گردد . تکثیر اولیه بوسیله 1 سیکل در دمای 94c برای 2 دقیقه انجام می شود وبعد با 30 سیکل دناتوره کردن در دمای 94cبرای یک دقیقه دنبال می شود وتواماُ چسبیدن وطولانی شدن در دمای 68c برای 1/5 دقیقه انجام می شود . محصولات اولیه تکثیر یافته از ویروس های رشد کرده برروی تخم مرغ به نسبت 1 در 10000 قبل از تکثیر ثانویه رقیق می کردند . یک مقدار از محصول اولیه (2 l) سپس به 48 l از مخلوط ثانویه pcr حاوی 5 lاز10 xpcr buffr (ph:8/4)tris-hcl ,200mm) و (kcl 500mm و 1 l از مخلوط داکسی نوکلئوزید تری فسفات و 1/5 l از 3 l , 50mm mgcl2 ازهر پرایمر داخلی در 25 pmol/ l (amp227f , amp 622r) و 34/2 l از نوکلئاز-آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز اضافه می کنیم . نمونه ها در دمای 94c برای 1 دقیقه انکوبیت می شوند وسپس برای 32 سیکل در معرض 94c به مدت 1 دقیقه و60c برای یک دقیقه و72c برای یک دقیقه قرار می گیرند .
Amplicon های (413bp) بوسیله رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید قابل رویت
می شود و متعاقبا برروی ژل آگارز2% الکتروفور می شود . جدول شماره 2
-تعیین حساسیت روش (I RT-PCR) تیتراسیون عفونت زایی ویروس :
روش های عفونت زایی همانطور که قبلاُشرح داده شدبا تغییرات کوچکی انجام
می گیرد . تعداد10رقت (10 -10)
از ویروسهای syd/97(h3n2) و DK/sing/97(h5n3) و HK/1073/99(h,n2) در محیط ترانسپورت ویروسی تهیه گردید . (vtm) ذمان انکوباسیون به 72 ساعت دریک انکوباتور co2 در 37c تغییر پیدا می کند . سلولهای کلیه سگ madin-darby بوسیله گلوتارآلدئید5% فیکس گردیدند وپلاکه بوسیله رنگ آمیزی با محلول کربول فوشین 5% vol/vol قابل رویت شدند .
RT-PCR(ii) : مقداری ازمحلول تازه وزنده ازهرویروس(100 l) حل شده در vtm در مجاورت عصاره نوکلئیک اسید و RT-PCR همانطورکه قبلاُشرح داده شد قرارداده
می شود .
روش Heterduplex :
متدهای آنالیز hma که قبلاُ شرح داده شد برای مطالعه گونه های مشابه ویروس نقص ایمنی انسان تیپ 1 آداپته شدند . برای hma ، 3 l از نمونه محصول pcr با 3 l ازمحصول pcrرفرنس و /3 l از بافر hmaحاوی1 m nacl و 100mm tris (ph:7/8)
و 20mm edta مخلوط می گردد.
نمونه ها سپس در دمای 95cبرای 2 دقیقه دناتوره می شوند وسریعاُ تا دمای4c سرد می شوند . سپس برای 10 دقیقه برروی یخ گذارده می شوند .سپس بافر(1/3 l) gel loading اضافه می شود .
برم فنل بلو1% و glycerol و(g x ; tris-boric acid-edta{tbe} , 1% xylen cynol) نمونه ها برروی ژلهای پلی ساکاریدی غیر دناتوره 8% در(nove x TBE ) 1 x TBE برای 50 دقیقه در ولتاژ 200V الکتروفورز می شوند.همودوبلکس ها وهترودوبلکس ها بدنبال رنگ آمیزی ژل با sybr greenII قابل رویت می شوند.
تعیین توالی وبررسی فیلوژنیک : تعیین توالی نوکلئوتیدی amplicon های pcr m ژن بااستفاده از روش dye deoxy terminator انجام گرفت .
محصولات PCR m ژن بااستفاده از جفت پرایمر داخلی PCR amp227f و amp622r در 3/2 pmol/reaction تعیین توالی شدند. بررسی فیلوژنیک خوشاندی به دنبال تعیین توالی با استفاده از برنامه magaling4 انجام گرفت .
نتایج :
- تعیین میزان حساسیت و اختصاصی بودن RT-PCRبرای m ژن: حساسیت تشخیص ویروس آنفولانزایA بوسیله روش RT-PCR برای Mژن با استفاده از سه ساب تیپ ویروس آنفولانزایA به نامهایsyd/97(h3n2) و dk/sing/97(h5n3) و Hk/1073/99(h9n2) انجام گرفت . رقتهای سریال و متوالی از عصاره ویروسی تازه این ویروسها در vtm تهیه گردید. ازهررقتی، نوکلئتیک اسیدها برای سنتز cDNA و PCR جمع آوری شدند. به همین میزان نیز به ارزیابی عفونت زایی این روش ازهررقتی گرفته شد که همان روز انجام گرفت در این الگو ، رقت نقطه پایان برای عفونت زایی ویروس می توانست مستقیماُ با نقطه پایان تشخیص RNA ویروسی بوسیله RT-PCR مقایسه گردد.
M ژن که برای RT-PCR به کارمی رود 10pfu از ویروسهای آنفولانزایA (H9N2 , H5N3 , H3N2) درمیلی لیتر می باشد .این با حساسیت گزارش شده برای تشخیص ویروسهای آنفولانزایA وB بوسیله روش NESTED RT-PCR بااستفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای HAاز ویروسهای آنفولانزایA وB می باشد.RT-PCR برای میزان توانائیش در تشخیص ویروسهای آنفولانزایA از انواع حیوانات ومیزای اختصاصی بودنش برای ویروسهای آنفولانزایA مورد آزمایش قرار گرفت .
یک محصولی با اندازه ای که انتظار می رفت (413bp) هنگامی که ویروسهای آنفولانزای A مرغی ، انسانی یا خوکی آزمایش شدند بدست آمد . (جدول 1 و شکل 1)
این نتایج نشان می دهد که توالی های mژن ویروسهای آنفولانزای A تمام حیوانات آزمایش شده را می توان با پرایمرهای لیست شده در جدول 2 تکثیر کرد .یکسری محصولات نامعلوم PCR هنگامی که ویروسهای آنفولانزایB تست شدند مشاهده شدند ، که دلالت بر اختصاصی بودن PCR برای توالی های ویروسهای آنفولانزای A می کند .
تعیین مشخصات آمپلیکونهای Mژن بوسیله HMA وتائید توالی های آن :
بعد از تکثیر Mژن بوسیله RT-PCR اختصاصی بودن محصول PCR برای هرویروس بامنشا میزبانی خاص بوسیله HMA مورد تحقیق وتخصص قرارگرفت . این کار با استفاده از بررسی طریقه فرم گرفتن هترودوبلکس بین آمپلیکونهای یک ویروس آنفولانزایA انسانی رفرنس (bay/95) وآمپلیکونهای ویروسهای مورد آزمایش از 15 ویروس آنفولانزای A مختلف از ساب تایپهای انسانی و خوکی ومرغی صورت گرفت . (جدول شماره یک ) (نتایج در شکل 2 نشان داده شده اند)
هترودوبلکس هایی که بین آمپلیکونهای سویه رفرنس (BAY/95) ومحصول PCR هر ویروس مورد آزمایش مشاهده می شوند ، منعکس کنند تغییر توالی بین ویروس رفرنس وDNA ویروس مورد آزمایش می باشد .
هیچ هترودوبلکسی در ستونی که حاوی فقط محصول PCR رفرنس می باشد مشاهده نمی شود .(lane 1,17) .کمترین کاهش در تغییر هترودوبلکس درجایی مشاهده می شود که محصول ویروس رفرنس (bay/95) با آمپلیکون ویروس wuh/371/95 مخلوط گردیده است (lane 2) . هر دو ویروس bay/7/95 و wuh/371/95 از
سویه های ویروس آنفولانزای انسانیA ،H1N1 می باشند .
بررسی توالی ها بر این امر دلالت می کند که آمپلیکونهای Mژن ویروسbay/95 و wuh/371/95 تا 9/1% اختلاف دارند .(جدول 3)
بنابراین آمپلیکونهای با بیشتر از 2% variation درتوالی نوکلئوتیدی بوسیله این روش HMA می تواند متمایز گردد .
هیچ اصلاحی در دوباره حل شدن باند وقتی که 10% ، 20% ، یا گرادیان ژلهای پلی آکریل آمید استفاده شد مشاهده نشد . بیشترین میزان کم شدن در تغیرپذیری در ستونی مه آمپلیکون رفرنس از bay/95 با محصولات pcr ویروسهایی که دارای mژنهای ویروسی خوکی یا مرغی مخلوط شده اند مشاهده می گردد .(ستون 3 و4 و7 تا 16). اختلافات نوکلئوتیدی بین آمپلیکونهای pcr از این ویروسهای مرغی وخوکی وویروس رفرنس انسانی سویه bay/95 بوسیله بررسی توالی بین 5/14% و 4/21% مشاهده شد . (جدول 3) میزان متوسط الگوی تغییر هترودوبلکس در مخلوطهای حاوی آمپلیکونهای pcrاز ویروسهای انسانی (bay/95) H1N1 وویروسهای انسانی H3N2 تست و syd/97 و wuh/359/95 مشاهده شد (بترتیب ستون 5 و6) بررسی توالی ها یک اختلاف نوکلئوتیدی 7/6 تا 9/7 درصدی را بین ویروس H1N1 انسانی و آمپلیکونهای mژن ویروس انسانی H3N2 تست مشاهده شد .(جدول 3)
ارزیابی یک الگوی رفرنسHMA برای تعیین انتقال بین گونه ها :
یک پانل از 9 و یروس آنفولانزای A با ژنهاب M که در دودمان انسانی ، خوکی وطیور وجود دارند ساخته شد .
RNA از اینها و یک ویروس تست خالص سازی می شود (HK/1073/99) و RT-PCR روی آن انجام می گیرد . (شکل3)
آمپلیکونهای با اندازه ای که اتنظار می رفت (314bp) بوسیله ژل آگاروز الکتروفورز قابل رویت می شود (شکل (A 3 یک قسمتی از هر آمپلیکون رفرنس برای hma با محصول pcr ویروس تست (HK/1073/99) مورد استفاده قرار گرفت . (نتایج در شکل 3B نشان داده شده است ). بیشترین کاهش در تغییر پذیری هترودوبلکس هنگامی مشاهده شد که آمپلیکون HK/1073/99 با آمپلیکونهای ویروس انسانی رفرنس مخلوط گردید . (ستون 1 و 2)که دلالت بر فاصله زیاد توالی Mژن ویروس مرغی با انسانی دارد . هترودوبلکسهایی که هنگام مخلوط کردن محصول PCR ویروس HK/1073/99 با آمپلیکونهای رفرنس مشتق شده از ویروسهای خوکی و انسانی تشکیل شدند الگوهای تغییر پذیری گوناگونی را نشان دادند (ستون 3و9)
بیشترین شباهت را با آمپلیکون PCR ویروس مرغی QU/HK/GI/97 H9N2 مشاهده شد (ستون7) . هیچگونه هتروبلکسی هنگامی که آمپلیکونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 مخلوط شدند مشاهده نشد که دلالت بر کم بودن اختلاف این آمپلیکونها از میزان حساسیت تست HMA دارد. نتایجHMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمپلیکونهای PCR ، Mژن از 9ویروس رفرنس وویروس تست تائید گردید. بررسی توالی ها نشان داد که اختلاف نوکلئوتیدی بین آمپلیکونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 بمیزان 1/1%می باشد .
- بحث :
بیشترین شباهت را با آمپلیکون PCR ویروس مرغی H9N2 Qa/HK/GI/97 , مشاهده شد « ستون 7» . هیچگونه هترو دوبلکسی هنگامی که آمپلیکونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 مخلوط شده اند مشاهد نشد که دلالت بر کم تر بودن اختلاف این آمپلیکونها از میزان حساسیت تست HMA دارد . نتایج HMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمیلیکونهای PCR ، mژن از 9 ویروس رفرنس و ویروس تست تایید گردید . بررسی توالی ها نشان داد که اختلاف توکلئوتیدی بین آمپلیکونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 به میزان 1/1% ازخوک یا طیور به انسان کم
می باشد اما چنین وقایعی می توانند منجر به میزان بالایی مرگ ومیر می شود واحتمال پدید آمدن ویروسهای جهانی را به دنبال دارد .
تشخیص زود هنگام وتعیین خصوصیت واریانت های جدید آنفولانزا که پدید آمده اند یکی از اهداف شبکه جهانی حفاظت درمقابل آنفولانزا سازمان بهداشت جهانی می باشد .
از این رو ، دست یابی به تستهای سریع که بتواند ویروسهای جدید و غیر معمول که ممکن است دارای یک منشا به صورت مخزن حیوانی باشند ضروری است . متدهای سریع ، مانند ایمونوفلورسنس و enzyme immunoassay برای تشخیص ویروسهای آنفولانزا در نمونه های کلینیکی به کار رفته اند .
گزارش شده که روش ها دارای اختصاصیت وحساسیت متغیری هستند و مشخص نیست که چگونه معرفهای دخیل دارای توانایی معادل در تعیین ساب تایپهای ویروسهای آنفولانزای حیوانات مختلف هستند . ارزش روشهای PCR برای تشخیص ومحافظت ویروسهای آنفولانزا در مواد کلینیکی بخوبی نشان داده شده است . روشهای تکثیر برای تشخیص و ساب تایپ کردن ویروسهای آنفولانزای A وبرای تفریق ویروسهای آنفولانزای A,B,C شرح داده شده است . لیکن این روشها به طور اختصاصی برای تشخیص ، نگهداری ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده اند وبیشتر احتیاج است که تستهای سریع جهت تشخیص ویروسهایی که میزبان آنها موجوداتی غیر از انسان هستند طراحی گردند ، اخیراً یک RT-PCR تک لوله ای بر پایه m ژن برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A مربوط به چند گونه شرح داده شده است .
دراین مطالعه ما یک متد توام PCR-HMA را برای شناسایی وتعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف طراحی کرده ایم .
ژنm1 بعنوان هدف انتخاب شد چراکه شواهد چنین پیشنهاد می کنند که m1 ORF در میان ویروسهای آنفلولانزای A از گونه های مختلف میزبان به میزان زیادی حفاظت شده هستند. RT-PCR برای mژن نشان داده شده که برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A ، 15 ساب تایپ مختلف با منشاء انسانی ، مرغی وخوکی اخصاصی وحساس می باشد . متدهای بعد از تکثیر برای بررسی تغییر توالی در آمپلیوکنهای PCR شامل بررسی RFLP ها و HAM ها می باشد.
ارز یابیRFLP ، محصولات m ژن PCR برای ساب تایپینگ ویروسهای آنفلانزای A انسانی و تفریق 6 ژن داخلی شامل m ژن ویروسهای انسانی H1N1,H3N2 , و ویروسهای مرغی H5N1 شرح داده شده است . اشکال احتمالی تکنیک RFLP این است که موتاسیون در توالی نوکلئوتیدی آن مورد نظر ممکن است منجر به از دست دادن یا پدید آمدن باند شدن آنزیم محدود کننده شود . میزان بالای موتاسیون پذیری RNA ژنوم ها ، مانند ژنهای ویروس آنفولانزا احتمال رخ دادن این موتاسیونها را افزایش می دهد .
از آنجائیکه که بررسی هترودوبلکس نشان داد که برای تفریق سریع ویروسهای RNA دار بسیار مناسب می باشد وبدلیل اینکه سایتهای مناسب آنزیمهای محدود کننده که ویروسهای انسانی ، مرغی وخوکی را متمایز می سازد در آمپلیکون 413 bp ژن m شناسایی شده اند ، HMA برای تعیین خصوصیات آمپلیکون m ژن انتخاب شد .
HMA بر مشاهده تغییرات توالی بین آمپلیکون های ویروس تست که باعث پدید آمدن جفت نشدن درست با سویه رفرنس می شود ودر نتیجه هترودبلکس ها متعاقباً دناتوره می شوند ودوباره می چسبند استوار است .
هتروبکلس ها آهسته از همودوبلکس های هم اندازه خود مهاجرت می کنند وکاهش قابلیت حرکت متناسب با میزان اختلاف بین دو توالی موجود درمخلوط دارد . درجه تغییر مورد نیاز برای تفریق مناسب هترودوبلکس ها نشان داده شده که بین طیف 25 و 5%
می باشد .
درجه اختلاف بین آمپلیکونهای m ژن مرغی ، خوکی ، وانسانی بینابین طیف
می باشد وباعث تشکیل هترودولکس ها ی قابل تشخیص می شود . « جدول 3 »
شیفت در mobility هترودوبلکس مشاهده شد که مرتبط با اختلاف بین DNA تست و رفرنس بود که اختلافی به کمی 9/1 تا 1/1 % اختلاف توکلئوتیدی قابل تشخیص بود .
این موضوع با گزارشات قبلی تعیین اختلاف 4 تا 4/1 درصدی قابل قیاس بود . در این کار بهترین تمایز بوسیله HMA هنگامی مشاهده شد که محصولات اولیه PCR قبل از تکثیر ثانویه رقیق شد .
از این موضوع می توان نتیجه گرفت که هنگام آزمایش مستقیم نمونه های کلینیکی که حاوی تیترهای پائین تری از ویروس نسبت به مواد رشد کرده بر روی تخم یا سلول هستند این کار ضروری نخواهد بود .
مناسب بودن متد PT-PCR HMA ما برای جستجوی نمونه های در یک شیوع بوسیله مقایسه یک تست ویروس با یک RAMEL ویروسهای رفرنس ارزیابی می گردد . سویه آنفولانزای مرغی H2N2 ( HK/1073/99 ) بعنوان ویروس تست انتخاب گردید چرا که این ویروس مرغی از یک بچه 4 ساله درهنگ کنگ جدا شده است.
یک ارتباط عالی بین نتیجه HMA و اختلاف نوکلئوتیدی وجود دارد برای تشخیص بوسیله تعیین توالی مستقیم وبررسی پلی ژنتیک آمپلیکونهای ویروس تست و رفرنس .
بوسیله HMA، آمپلیکون PCR رفرنس مربوط به Qa/HK/GI/97 ارتباط دارد . این ارتباط بر اساس گزارشات
 

قبلی با 1% اختلاف توکلئوتیدی بین m ژنهای HK/1073/99 , Qa/HK/GI/97 همراه می باشد . درمجموع ، نتایج کار ما نشان می دهد که انجام توام HMA,RT-PCR بر روی m ژن یک ابراز قوی برای تشخیص وشناخت ژنتیک ویروسهای آنفولانزا می باشد .HMA یک راه ساده وحساس برای جستجوی m ژنهای ویروس های آنفولانزای جدا شده می باشد وفقط 36 تا 24 ساعت وقت لازم دارد . اگر چه متد RT-PCR HMA برای بررسی نمونه های دستگاه تنفس در این مطالعه مورد استفاده قرار نگرفته ولی چنین نتیجه گیری می شود که این متد می تواند بطور مستقیم برای تست ویروسها در نمونه های کلینیکی به کار رود بدون اینکه ضرورتی به رشد ویروس اول بر روی سلولهای محیط کشت یا جنین تخم مرغ باشد .
حساسیت روش m ژن RT-PCR که شرح داده شد قابل قیاس با حساسیت روش RT-PCR که در آن از پرایمرهای اختصاصی ژنهای HA ویروسهای آنفولانزای B,A برای تعیین ویروسهای آنفولانزای B,A به طور مستقیم درنمونه کلینیکی می شود
می باشد . ویروسهای آنفولانزای جدید وغیر معمول را که بوسیله HMA شناسایی
شده اند می توان بسیار وسیعتر بوسیله تعیین توالی مستقیم و HI تایپینگ شناسایی وتعیین خصوصیت کرد . پانل HMA ویروس رفرنس را که ماساختیم نیاز خواهد داشت که با اطلاعات بدست آمده از ویروسهای که در بین انواع حیوانات درچرخش است به روز شود . سرانجام ، تکنیک ترکیبی RT-PCR هترودوبلکس می تواند برای شناسایی دیگر ژنهای داخلی ویروس آنفولانزا بکار رود .
بیماریزای عصبی ویروس آنفولانزای H5N1ژنوتیپ جدا شده از طیور هنگ کنگ در 2001 در موش
خلاصه :
ما پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ مختلف ( E تا A ) را از ویروسهای آنفولانزای مرغی H5N1 مطالعه کردیم که حاوی ژنهای HA مشابه ویروس H5N1 A/goose /Guangdong/1/96 و 5 ترکیب مختلف ژنهای داخلی در یک مدل موشی می باشد . واریانت های نوروتوپیک وبسیار پاتوژن ویروس از ژنوتایپهای A,C,D,E از مغز بعد از یک پاساژ داخل بینی در موش جدا شدند . ژنوتیپ ویروس B فقط از ششها جدا شدند .واریانت های مغز موش دارای آمینواسیدهای تغییر یافته در محصولات تمامی ژنهایشان بجز پروتئین های PB1,NP,NS1 بودند اما شامل موتاسیونهای معمول نبودند . ما نتیجه گرفتیم که منشاء ژنوتیپی H5N1/01 از A,C,D,E بصورت هتروژنوس می باشد ودیگراینکه ورایانت های بسیار پاتوژن نوروتروپیک می توانند سریعاً در موش انتخاب شوند .

 

بیماری آنفولانزای طیور (قسمت سوم )

 

مدیریت بیماران :

گرفتن نمونه خون ودستگاه تنفس و ارسال به آزمایشگاه برای تست آنفولانزا و دیگر عفونتهایی که علائم بالینی مشترک دارند . درمان با اینهیبیتور نورآمینیدازها مانند Oseltamivir  (بصورت 75mg خوراکی ، دوبار در روز ) بعنوان اولین مراحل درمان بکار میرود .

اگر که علائم بالینی ظاهرشد بیمار بایستی در بخشی که قبلا توضیح داده شد برای کنترل عفونت بستری گردد  .اگر که تشخیص داده شد بیمار نیاز به بستری شدن ندارد بایستی به بیمار وخانواده اش ضوابط بهداشت فردی و کنترل عفونت (برای مثال: شستن دستها، استفاده از ماسک کاغذی یا جراحی برای شخص بیمار وپرهیز از تماس جمعی) آموزش داده شود اگر که نیاز دارد توسط دارو تحت درمان حمایتی قرار گیرد همچنین بیمار با پزشک معالج توسط تلفن و یا ویزیت شدن در تماس باشد . درمانهای حمایتی شامل مراقبت از اشباع بودن اکسیژن واستفاده از ذخیره اکسیژن در صورت کم شدن اکسیژن ماسکهای اکسیژن nebulizer و یا  high-air-flowدر سندرم عفونت حاد تنفسی برای پیشگیری از انتشار تنفسی بکار می رود  .

این توصیه ها فقط هنگامی که بیماری شدید باشد و کنترل آن مشکل می باشد مورد نیاز هستند  .
گرفتن نمونه های خون وتنفسی بطور مرتب برای چک کردن عفونتهای باکتریایی احتمالی مورد نیاز می باشد . استفاده از درمان آنتی بیوتیکی به صورت تزریقی را نیز باید در نظر داشت . از آمانتیدین یا ریمانتیدین استفاده نکنید بدلیل خطر افزایش موتاسیون انتخابی در جهت مقاومت ویروسی با توانایی جهانی شدن . نتایج اولیه که توسط مراکز مختلف بهداشت جهانی بدست آمده پیشنهاد می کند که ویروس آنفولانزای A (H5N1) که اخیرا از انسانها جدا شده اند نسبت به آمانتیدین و ریمانتیدین مقاوم می باشند .

پرهیز از تجویز سالیسیلاتها (مانند آسپیرین) در بچه های زیر 18 سال بدلیل ریسک سندرمReye  .

استفاده از Paracetamol یا Ibuprofen با هم بصورت خوراکی یا شیافت برای کنترل تب.
تعدیل کنندهای سیستم ایمنی مانند کورتیکواستروئیدها بایستی فقط به موازات عملیات کلینیکی صورت گیرد. پاسخ ایمنی انسان در مقابل آنفولانزای A (H5N1) هنوز نیاز به مطالعات بیشتری دارد .
از Ribavirin استفاده نکنید. هیچگونه شواهدی دال بر موثر بودن این دارو بر علیه آنفولانزا وجود ندارد در عوض عوارض ناخواسته مانند آنمی شایع می باشد و ممکن است که بیمار را بیشتر به مخاطره برای فهم بهتر الگوی دفع ویروس در انسانهای عفونی شده با ویروسها A (H5N1) در شیوع آنفولانزا در تایلند و ویتنام نیاز به مطالعات بیشتری می باشد . تا اینکه شواهد دیگری به دست آید در حال حاضر WHO توصیه کرده است که ضوابط کنترل عفونت تا 7روز بعد از قطع تب ادامه پیدا کند .
مطالعات قبلی برروی آنفولانزا براین امر که کودکان با سن کمتراز 12 سال می توانند برای 21 روز پس از شروع بیماری ویروس را دفع کنند می باشد . بنابراین ، برای کنترل عفونت بهتر است که کودکان برای این دوره در محل مراقبت باقی بمانند . کودکان در این مدت نبایستی به مدرسه بروند .
افرادی که بااین بیماران در تماس مستقیم بوده اند بایستی برای 7 روز تحت نظر قرار گرفته شوند و دمای بدن آنها دوبار در روز چک شود اگر که فردی تب بالاتر از 38 درجه و سرفه یا تنگی نفس را نشان داد بایستی بلافاصله درمان شود .بیاندازد .

آنفولانزای مرغی جدید در دانمارک، 10000 اردک را ازبین برد .ویروس A H5N1 در اردکها شناسایی شد .
یک نوع جدید ویروس A آنفولانزا ،H5N1 ، برای اولین بار در اردکهای دانمارکی شناسایی شد . بدنبال ظهور بیماری بین 12000 اردک . در یک مزرعه اردک نزدیک به شهر Salling در Jutland_ دو ویروس شناسایی شدند : یک ویروس عامل Entritis در اردک (DVE) ،که عامل بیماری بود ویک ویروس آنفولانزای A .

تمامی اردکها بطور خیلی وسیعی در 10 سپتامبر 2003 درگیر بیماری شدند . ویروس آنفولانزای A از بافت تعدادی از اردکها جدا شد . انستیو سرم سازی Statens از RT – PCRطول کامل هماگلوتینین و نورآمینیداز با تعیین توالی روتین که ترجیحا بطور مستقیم برروی نمونه ها انجام می گیرد تا برروی ویروسهای کشت داده شده استفاده کردند و ژنوتیپ این ویروس را H5N7 نام نهادند .
این تایپ قبلا هیچ گاه شناسایی نشده بود و بررسی های بیشتر هم اکنون برروی آن در حال انجام است . نکته با اهمیت اینکه این ویروس در انسانها تشخیص داده نشده بخصوص در میان افرادی که با این اردکها تماس داشتند یا در تعدادی موارد غیر مرتبط ویروس آنفولانزای (H3N2) A در دانمارک از 1 سپتامبر 2003 تشخیص داده شد . 12 سویه ویروس آنفولانزای مرغی (AIV) A از پرندگان وحشی در دانمارک از 1996 جدا شد که هیچ کدام از آنها H5 یا H7 نبود.

مقدمه :
ویروس آنفولانزای مرغی FPV Rostock بر روی سلولهای L موش پلاک تشکیل
نمی دهد . طیف میزبانی ویروس موتانت FPV Doboson یک ویروس که بطور نزدیکی FPV Doboson مرتبط می باشد بوسیله پاساژهای مکرر در انواع سلولهای پستانداران شامل سلولهای L ,Hela ,BHK انتخاب شد . این ویروس ، که بعنوان Dobson 4H شناخته شده ، پلاک های شفاف در سلولهای L تشکیل می دهد . کارهای قبلی با ویروسهای نوترتیب نشان می دهد که فنوتیپ تشکیل دهنده پلاک بوسیله قطعه 1RNA که تحت واحد PB2 از کمپلکس پلی مرازی ویروسی راکد می کند پدید می آید . ما در حال تلاش برای فهم اساس ملکلولی این محدود شدن طیف میزبان هستیم چرا که ممکن است سر نخ های مهمی را در مورد وقایعی که انتقال ژنوتیک ویروسهای آنفولانزای مرغی را به مزبانهای پستانداری افزایش می دهد به ما دهد ( 7، صفحه 5 )

بحث :
دلیل اینکه چرا تغییرات در پروتئین PB2 ممکن است سبب از دست دادن توانایی تشکیل پلاک بر روی رده سلولی پستانداران می شود هنوز روشن نشده است . PB2 یک بخش محلق شونده به کمپلکس پلی مرازی است . SHIH ,Krug پیشنهاد کردند که باند شدن پلی مراز ویروسی با پروموتورتاخیری درعفونت ممکن است چنگال همانند سازی را تنظیم کند وهمچنین نشان داده اند که چنگال همانند سازی بستگی به پروتئین های سلول میزبان دارد .
این مسئله که تغییر در توالی های PB2 اثر می گذارد بر روی تمایل کمپلکس پلی مرازی برای اینکه RNA بتواند نقص در تنظیم چنگال را در سلولهایی که فاقد یا دچار کمبود درفاکتورهای عمده سلول میزبان هستند جبران کندقابل درک می باشد.(7، صفحه 6)
همبستگی آنتی ژنتیک بین نورآمینیداز A/H5N1 وآنفولانزای پاندمیک 1918
پاندمیک های A/H5N1 ما را بر آن داشت که وضعیت سرولوژیکی جمعیت های فرانسوی را در مقابل سویه A/HK/156/97 بررسی کنیم . (7 صفحه 11)
بحث :
مشاهدات هنگامی انجام گرفت که 198 سرم فاقد آنتی بادی های anti-A/HK/145/97 HI در تست NIدر مقابل ویروس A/HK گزارش شد وسپس هنگام بررسی به عنوان یک فعالیت بر روی گروههای سنی ، ما ابتدا اساس کارمان را بر روی افرادی که دارای ملاقات با سویه های پاندمیک 1918 ویا 1934 بودند گذاردیم . درواقع ، یک طیف غیر منتظره بالا از شیوع آنتی بادی های anti-A/HK NI در سرمهای افرادی با دو محدوده سنی 75-95 و 98-76 مشاهده شد در حالی که یک شیوع خیلی پائینی در اشخاص زیر 59 سال دیده شد . شباهت نزدکی بین شیوع سنی پروفیل آنتی بادی های anti-A/HK NI و anti-A/HK نزدیکی ارتباط آنتی ژنیک را بین NA این دو ویروس پیشنهاد می کند .
سرمهای متعدد انسانی مشاهده شده که قادر به خنثی سازی عفونت زائی ویروس A/HK در محیط آزمایش هستند ، بطور عمده سرمهایی که متعلق به افراد با گروه سنی 98-76 سال می باشند . همچنین متعاقباً شیوع آنتی بادی NT بسیار مرتبط با شیوع آنتی بادی NI در این گروه می باشد ( anti A/HK , anti-A/PR8 ) برعکس آن چیزی که درگروه سنی 60 تا75 سال مشاهده شد .
از این اطلاعات می توان دلائل منطقی برای فرضیه های زیر آورد :
در گروه سنی 60 تا75 سال ، وجود قبلی آنتی بادی های NI احتمالا در اثر تماس مستقیم با ویروس A/PR8 می باشد ، قادر بود که فعالیت آنزیماتیک ویروس A/HK ممانعت به عمل آورد اما نمی تواند اثر خنثی کنندگی بر روی عفونت زائی ویروس داشته باشد .
در گروه سنی 76 تا98 وجود قبلی آنتی بادی های NI احتمالا به دلیل تماس مستقیم با سویه پاندمیک 1918 قادر است از فعالیت آنزیماتیک هر دو سویه A/PR8 , A/HK جلوگیری می کند وهمچنین می تواند از اثر خنثی کننده بر روی ویروس A/HK داشته باشد .
دراین مطالعه ، حذف نقش احتمالی آنتی بادی های anti-HA ما را قادر می سازد که راه احتمالی نقش حفاظت کنندگی آنتی بادی های ضد NA را بوسیله نشان دادن قدرت خنثی سازی بعدی ها پیدا کنیم .
اطلاعات ما دلایل سرولوژیکی برای نزدکی ارتباط بین NA از A/HK وسویه H1N1 که در پاندمی 1918 جدا شد می آورد . چنین همبستگی آنتی ژنیکی بین این دو نورآمیینداز با اطلاعاتی که مادرباره توالی های نوکلئوتیدی آنها داریم سازگار
می باشد . بعلاوه ، yuen وهمکارانش در سال 1998 و Glass وهمکارانش در سال 1998 پیشنهاد کردند که ویروس H1N1 مسئول پاندمیک انسانی مه 1918 باعث داخث شدن مستقیم ویروس آنفولانزا به جمعیت انسان بوده است . (7 ، صفحه 13 )
قسمت دوم : پاتوژنزیس ، ویرولانس و ایمنی
تغییرات ساختمانی هماگلوتینین ویروس آنفولانزا که بیماریزایی راتحت تاثیر قرار
می دهد .
هماگلوتین ویروس انفولانزای مرغی (AI) به نظر می رسد که دارای این خصوصیت منحصر به فرد است که آمینواسیدهای بازیک رادر جایگاه برش پرتئولتیک خود قبول می کند (PCS ) . همراه بودن امینواسیدهای چندتایی بازیک با انتشار بافتی و بیماریزائی توسط سویه های AI اولین بار توسط Klen K, Rott, orlich ودیگران در اواخر 1970 پیشنهاد شد وبرای دو دهه همچنان حفظ شده است . در حالی که دیگر خصوصیات ساختمانی و دیگر ژنهای نیز می توانند بطور عمده بیماریزایی را تحت تاثیر قرار دهند ، وجود آمینواسیدهای چندتایی بازی در pcs یک ساختمان نشان دار را پدید می آورد که ادامه بررسی توالی های سویه های AIجدا شده از مزارع را توجیه می کند .
بعلاوه ، با این شمای ساختمانی نوک HA را مستعد نمایان و پنهان کردن محل های گلیکوز یلاسیون می کند ، که تعدادی از انها با بیماریزایی همراه هستند.
برای مثال، درآزمایشگاه ما نشان داده شده که وجود کربوهیدراتها نزدیک به محل باند شدن بارسپتور ( RBS) یک ویروس جدا شده AI از نوع H7 با افزایش بیماریزائی در جوجه ها همراه بود .
ویروسهای H5N1 که در سال 1997 در هنگ کنگ ظاهر شدند از دو نظر منحصربه فرد بودند هم از نظر ساختمان پروتئین HA شان وهم از نظر پاتولوژی در حیوانات . این ویروسهای مرغی حاوی آمینواسیدهای بازی چندتایی درمحل برش بودند ویک محل اضافه شدن کربوهیدرات قابل موتاسیون در قسمت نوک محل باند شدن بارسپتور . آنها بسیار در جوجه ها کشنده بودند اما برخلاف دیگر سویه های شدیداً بیماریزایی AI آنها برای موش نیز کشنده بودند . پس این ویروسها یک مدل
ایده آل برای مطالعه شمای ساختمانی HA ویروسهای بسیار پاتوژن را فراهم
می آورند . ( 7، صفحه 14 )
تعیین خصوصیات یک ( Alty/Eng/87-92/91) H5N1 جدا شده که دارای آمینواسیدهای باز یک چند تایی درمحل برس HA می باشد .
دو ویروس H5N1 از فقط یک اردک طی شیوع آنفولانزای مرغی شدید (HPAI) در Norfolk انگلیس درسال 1991 جدا شد . یکی که (A/ty/Eng/50-92/91 ) برای طیور اهلی خیلی بیماریزا بود دارای اسیدآمینه های چندتایی باز یک در محل برش HA بود و بخوبی درسلولهای MDCK بدون اضافه کردن تریپسین رشد می کرد که از خصوصیات تیپیک ویروسهای ( HPAI) می باشد .
دیگری (A/ty/Eng/87-92/91 ) دارای محل برش مشابه بود اما بیماریزانبوده وبر روی سلولهای MDCK حتی با اضافه کردن تریپسین رشد نمی کرد . دو ویروس جدا شده هیچ فرقی از نظر ژن HAکه با بیماریزائی آنها مرتبط است نداشتند . این مطالعه بر روی رشد و خصوصیات ملکولی پاساژ یک رقت محدود کلون ( A/ty/Eng/87-92/91) می باشد . « 7،‌صفحه 14 »
بحث :
ویروس (A/ty/Eng/87-92/91) H5N1از مغز یک اردک که دراثر HPAI مرده بود جدا شد . لیکن ، کلون LDP3 بدست آمده از این ویروس قادر نبود که در بدن منتشر شود یا درمغز جوجه هاواردک ها تکثیر پیدا کند همانطور که درمورد ویروسی با آمینو اسیدهای باز یک چندتایی در محل برش انتظار می رود . پاساژ در جنین 14 روزه تخم مرغابی براحتی موتاسیونهایی را از کلونهای غیر بیماریزای LDP3 از A/ty/Eng/87-92 که می توانست در سلولهای MDCK درغیاب تریپسین رشد کند انتخاب کرد .
این موضوع مخالف با پاساژ LDP3 در جوجه ها یا جنین 10 تا 11 روزه تخم مرغابی بود که در تولید موتانت هایی که بتوانند در MDCK رشد کنند . این افزایش بیماریزائی لیکن ، به بیماریزائی در جوجه ها ترجمه نمی شود ، کلون G30 یک IVPI از تغییرات O.NO به نظر می رسد در توالی های نوکلئوتیدی HA وابسته به ویروس والد LDP3 می باشد و بنابراین فشار انتخابی ، باعث توانایی رشد موتانت های B22,G33 در سلولهای MDCK شده بایستی در جای دیگری از ژنوم قرار گیرد .
آزمایشات نوترتیبی منجر به این حدس شد که ژنهای ماتریکس و PB2ممکن است که درتعدیل پاتوژنسیته نقش داشته باشند . بنابراین ژن کامل PB2 برای کلون های 2L G33,LDP3 توالی نوکلئوتیدی بودند که بطور روشن 3 تغییر آمینو اسیدی از آن استنتاج شد که به نظر می رسید با بیماریزایی مرتبط باشد . لیکن ، تعیین توالی نسبی کلونهای 87V , 5L نشان داد که ارتباطی بین تغییرات آمینو اسیدی استنتاج شده و IVPI وجود ندارد .
اخیراً ، پیشنهاد شده است که گلیکوزیلاسیون اضافی HA همراه با یک ساقه کوتاه NA خصوصیات ویروسهای مرغی H7 , H5 می باشد . جالب اینکه ژنهای NA از A/ty/Eng/50-92/929 . LDP3 دارای یک حذف پیش بینی شده 23 آمینو اسیدی در مقایسه با A/parrot/NI/73 می باشد . لیکن هیچ یک از این ویروسهای جدا شده دارای محلهای گلیکولیزاسیون اضافی بر روی HA نبودند پس یک استثناء را برای این نقش پدید می آورد .« 7 ، صفحه 15 »
روش ژنتیک معکوس نشان می دهد که رشد ویروس آنفولانزا بوسیله گلیکوزیلاسیون هماگلوتینین تنظیم می گردد .
عفونت ویروس آنفولانزا بوسیله باند شدن ذره ویروسی با رسپتورهای اسید سیالیکی بر روی سطح سلول میزبان آغاز می شود . این عمل باند شدن توسط گلیکوپروتئین HA انجام می شود . منطقه ای از HA که با رسپتور باند می شود نشان داده شده که یک پاکتی از آمینو اسیدها در منطقه مسئول باند شدن دخیل می باشند . در HA ویروس طاعون مرغابی ها ( A/FPV/Rostock/34 ) این پاکت باند شونده در طرفین خوددارای دو زنجیره جانبی الیگو ساکارید N-Linked می باشد . در مطالعات قبلی که درآن موتانتهای FPV-HA فاقد هر یک « موتانت G1,G2» یا دو « موتانت G1,2 » محلهای ژنهای گلیکوزیلاسیون بودند که به کمک یک وکتور SV40 بیان شدما نشان دادیم که این گلیکان ها تمایل باند شدن رسپتور را تعدیل می کنند.
دراین مطالعه ما بر روی این موضوع که چگونه این تخلیه گلیکانی بر روی رشد ویروس اثر می گذارد وقتی که HA موتاسیون یافته به طور پایدار از طریق یک روش ژنتیک معکوس به ویروسهای نوترکیب اضافه شود کار کردیم .
در این سیستم یک قطعه HA موتاسیون یافته شبه ویروس آنفولانزا در هسته سلولهای عفونی شده بوسیله RNA پلی مراز I سلولی از یک حامل پلاسمیدی نسخه برداری شد . بر اساس عفونت سلولها با یک ویروس کمکی مناسب قطعات موتاسیون یافته HA با ویریونهای پروژنی ترکیب می شوند .
دو ویروس نوترتیب A/WSN/33 بعنوان ویروسهای کمکی برای بوجود آوردن دو سری از ویروسهای نوترکیب موتانت HA مورد استفاده قرار گرفتند که فقط در NA که حمل می کنند فرق می کنند به ترتیب تحت تیپ های N1 یا N2 .
دراینجا ما نشان دادیم که فقدان یکی « موتانت G2» یا دوتا « موتانت G1,2 » گلیکان دارای اثر شدیدی بر روی رشد ویروسهای حاوی N1-NA اثر دارد که بطور عمده سبب آزادسازی یک ویروس پروژنی ترمیم نیافته از سلولهای عفونی می شود.
برای ویروسهای N2-NA چنین محدودیت های رشدی باموتانت G2 قابل تشخیص نیست با موتانت G1,2 کمتر ظاهر می شود . نتایج ما دلالت بر این می کند که بر هم کنش بین محل باند شدن رسپتور والیگوساکاریدهای مجاور HA برای توانایی رشد ویروسهای آنفولانزا درسلولهای میزبان تعیین کننده می باشد .« 7 ، صفحه 16 »
بحث :
بوسیله برداشت پشت سر م زنجیرهای جانبی الیگوساکاریدی از نوک ملکول HA ما نشان دادیم که فعالیت باندشدن رسپتور بتدریج بوسیله این گلیکانها تنظیم می گردد. بعلاوه ، این تنظیم باند شدن رسپتور بسیار وابسته به طبیعت جفت شدن NA ویروس است .
از آْنجایی که اخیراً شرح داده شده که گلیکوزیلاسیون HA وتحت تیپ NA یک نقش قطعی را در تعیین طیف میزبانی وسازگاری با میزبانهای جدید ویروسهای آنفولانزا دارد ما مراحل دستکاری اختصاصی این اعمال را به منظور ساخت یک ویروس یا خصوصیات رشد شناخته شده تعیین کردیم .
در نتیجه ، روش ژنتیک معکوس ما یک ابزار آزمایشگاهی عالی را برای مطالعه بر هم کشش وجفت شدن انواع مختلف HA,NA تولید ویروسهای آنفولانزا با توانایی تنظیم دقیق فعالیت باند شدن با رسپتور فراهم کرده است . « 7 ، صفحه 18 »
M1 پروتئین ویروس آنفولانزای A با PACK1 « رسپتور Cکنیاز فعال » انسانی تداخل پیدا می کند .
ویروسهای آنفولانزا اعمال سلول میزبانی را دستکاری کرده ودر اختیار خود
می گیرند . ما علاقمند به شناسایی فاکتورهای سلولی که بوسیله برهم کنش پروتئین – پروئین هدف ویروس قرار می گیرند هستیم .
ما قبلاً پروتئین هایی را که با پروتئین NS1 ویروسی تداخل دارند شناسایی کرده ایم و این مطالعات را بر روی پروتئین M1 ماتریکس از ویروس آنفولانزای A توسعه داده ایم گزارش شده که m1 پروتین هم نقش ساختمانی وهم نقش تنظیمی در سر هم بندی شدن ونشدن ویروس و تنظیم نسخه برداری RNA وانتقال داخل سلولی قطعات RNP ژنومیک دارد . بعلاوه ، M1 پروتئین های تحت تیپهای A,B,C روشن شده که بر روی بنیان ترئونین وسرین در سلولهای عفونی فسفریله شود . فسفریلاسیون قابل ملاحظه M1 پروتئین ومطابقت کینازها هنوز تعیین نشده است . ما فرض کردیم که یکی یا بیشتر ازخصوصیات M1 پروتئین بوسیله تداخلها با فاکتورهای ناشناخته سلولی تعیین می گردد. به منظور شناسایی چنین ترکیبات سلولی ، ما از سیستم مخمر دوهیبدریدی با پروتئین M بعنوان یک طعمه استفاده کردیم .
بعنوان یک نتیجه ، ما 4 کلون CDNA غیر وابسته را جدا کردیم که بطور اختصاصی با M1 پروتئین در سیستم دوهیبریدی مخمر تداخل داشت و با پروتئین بسیار حفاظت شده ( receptor of activated ) RACK1 بر هم کنش دارد .
RACK1 قبلاً پیشنهاد شده که بعنوان یک پروتئین رسپتور داخل سلولی برای فعال شدن پروتئین کنیاز C(PKC) عمل می کند . ما بر روی نقش احتمالی تداخل بین M1-RACK1 برای فسفریلاسیون M1 پروتئین بحث کردیم . ( 7 ، صفحه 18)

بحث ونتایج :
ما از M1 پروتئین بعنوان یک طعمه در سیستم دوهیبریدی مخمر برای جستجوی یک کتابخانه CDNA بیان شونده برای فاکتورهای تداخلی استفاده کردیم . 4 ، CDNA با پروتئین RACK1 انسانی که بطور اختصاصی با M1 پروتیین جدا شده باند می شدند مطابقت می کردند . بر هم کنش ژنتیکی بوسیله با هم رسوب دادن اختصاصی M1 پروتین از عصاره سلولهای عفونی با ویروس با استفاده از یک فیوژن پروتئین GST-PACK1 در روش GST-Pull down تایید شد.
PACK1 یک پروتئین 36 کیلو دالتونی بسیار حفاظت شده است که حاوی 7 دمین WD40 دارای انواع مختلفی از پروتئین های تنظیمی هستند و واسطه تداخل پروتئین یا پروتئین هستد . PACK1 پیشنهاد شد ه که بعنوان یک پروتئین رسپتور داخل سلولی که به فرم فعال PCK در غشاء ها یا ترکیبات اسکلت سلولی متصل می گردد .
با توجه به تداخل M1-PACK1 ما سردرگم شدیم اگر که PCK بتواند فسفریلاسیون M1 پروتئین را وساطت کند . ما توانستیم نشان دهیم که پروتئین نوترکیب M1 بوسیله PKC خالص در محیط آزمایشگاه فسفریله می شود . M1 پروتئین بوسیله PKC فسفریله می شود در طول عفونت ویروسی .
این یافته ها ممکن است دلالت بر این کند که عمل تداخل M1-PACK1 طی فسفریلاسیون M1 پروتئین انجام می گیرد . ( 7، صفحه 19 )
تغییرات ژنتیکی درحساسیت نسبت به Zanamivir در تکثیر invitro که بطور طبیعی در ویروسهای آنفولانزای مرغی رخ می دهد .
آنالوگ سیالیک اسید به نام Zanamivir
( 4-guanidino -2,4 – dideoxy -2,3 – dehydro –N-acetyneuraminic acid )
یک ممانعت کننده باتمایل واختصاصیت بالا از باند شدن طبیعی NA از ویروسهای آنفولانزای A,B می باشد. واریانت های مقاوم به Zanamivir ، که دارای موتاسیون در NA ویا HA هستندبه وسیله پاساژهای مکرر در حضور دارودر کشت بافت جدا شده اند . ما قبلا نشان دادیم که ویروسهای آنفولانزای معمول تغییراتی را در حساسیت همانند سازیشان نسبت به زانامیویر در کشت بافت نشان می دهند .
ویروس A/DUCK/Ireland/113/83 H5N8 « ویروس اردکی ایرلندی » بسیار حساس می باشد ، A/FPV/Egypt/45 H7N1 « Egyt» ، A/FPV/England/1/63 H7N3 ( Langham ) حساسیت متوسط و « یک ویروس نوترتیب که دارای HA,NAاز A/FPV/Kostack /34(H7N1) SD17 نسبتا مقاوم می باشد .
لیکن ، برای هر 4 ویروس ، فعالیت NA بوسیله زانامیویرممانعت می شود ، در حالی که فعالیت هماگلوتیناسیونی نسبتا به زانامیویر حساس می باشد.
ویروسهای نوترتیبی که از این 4 ویروس حاصله شده است ، به منظور شناسایی ژنهایی که درتغییر حساسیت نسبت به زانامیویر در in vitro وبرای شناخت مکانیسمی که این ژنها بر روی حساسیت تاثیر می گذارند مورد مطالعه قرار گرفته است .
این اطلاعات را می توان برای پیش بینی خصوصیات ویروسهای پاندمیک های جدید آنفولانزا درانسانها که ممکن است دراثر استفاده گسترده از داروی زانامیویز پدید آیند استفاده کرد ( 7، صفحه 21 )
بحث :
حساسیت های متفاوتی که نسبت به داروی زانامیویر در محیط کشت بافت وجوددارد را می توان بر اساس خصوصیات NA,HA آنها شرح داد .
ما پیشنهاد می کنیم که باند سیالیک اسید با موقعیت 158 از SD17 ممکن است پاکت باند شونده رسپتور را پر کند ، وبا سیالیک اسید برای چسبیدن به رسپتورهای سلولی ویا ذره ویروسی رقابت کند .
در نتیجه ، ویروسهایی که دارای این HA هستند می توانند با جدا شدن ازرسپتورها با کاهش وابستگی به فعالیت NA ودر کشت بافت کمتر به زیناویر حساس باشند. NA با ساقه بلند در آزاد سازی ویروس از رسپتورها کار آمدتر است تا
NA یی که دارای ساقه کوتاه می باشد ، همچنین NA هایی که دارای ساقه بلند هستند می توانند بطور کارآمد از رسپتورها درغیاب زانامیویر آزاد شوند لیکن ، به دلیل اینکه ساقه بلند NA نقش بیشتری را درآزاد سازی ویروس از سلولها نسبت به NA با ساقه کوتاه ایفا می کند ویروسهای با NA ساقه بلند نسبت به زانامیویر درکشت بافت حساس تر می باشند . ( 7 ، صفحه 23)
سیتوکاین ها در پاتوژنزیس آنفولانزا :
خصوصیات یک آنفولانزای بدون عوارض جانبی در انسان وحیوانات بوسیله شروع ناگهانی تب ، لرز ، در عضله وعلائم تنفسی می باشد .سلول هدف برای ویروس سلولهای اپی تلیال در طول کل دستگاه تنفس می باشد ، اما الگوی عفونت ودرگیر شدن قسمت پایینی دستگاه تنفس به نظر می رسد که در حیوانات مختلف فرق می کند . مطالعات هیستولوژیک قسمت بالایی دستگاه تنفس ویا ششها بطور تیپک نکروز سلولهای اپی تلیال و انفیلتراسیون نوتروفیلی رانشان می دهد . علی رغم توضیحات زیاد کلینکی وپاتولوژیک ، علت علائم بیماری و پاتولوژیکی هنوز کشف نشده باقی مانده .اما شواهد رو به رشدی دل بر اینکه تولید اولیه سیتوکاین درمحل عفونت نقش در ایجاد التهاب وعلائم دارد در دست می باشد . از میان این سیتوکاین ها می توان به اینترفرون ( IFN- ) ، فاکتور نکروز دهنده تومور ( TNF-) ، اینترلوکین 1 و اینترلوکین 6 وتعدادی کموکاین اشاره کرد .
این مرور بر روی تعدادی از نشانه هایی که سیتوکاین ها طی آنفولانزا در انسان وخوک :
سینتیک تعدادی از سیتوکاین ها طی عفونتهای تجربی آنفولانزا درانسان وخوک مورد مطالعه قرار گرفته است . در انسان تهوع ، بیماری سیتسمیک ودرگیری قسمت بالای دستگاه تنفس غالب می باشد . در طول دوره حداکثر بروز علائم IFN- , IL-6 , TNF- , IL-8 در ترشحات بینی یافت شده است .
IFN- و IL- ارتباط مستقیم با تیتر ویروس وشدت بیماری دارند. دیگر
سیتوکاین ها مانند IL-1B,IL-2 ,TGF-B دیده نشده که بطور قابل ملاحظه ای افزایش پیدا کنند .
با استفاده از خوکهای gnotobiotic ، یک مدل تجربی برای ایجاد آنفولانزای خوکی برای محققین آزمایشگاهی فراهم آمد . علائم تیپیک کلینیکی وپاتولوژی شامل تب ، عدم تعادل، افسردگی ، تنگی نفس شدید و یک برونکوپنومونیای نکروزیش
می باشد . سطح بالای IL-1 ,TNF- , IFN- در مایع برونشهای آلوئولار یک روز بعد از عفونت دیده می شود . وقتی که غلظت سیتوکاین ، تیترهای ویروس در شش وشمارش نوتروفیل در BAL مقایسه گردید ، یک ارتباط مستقیم بین هر سه وجودداشت .
بعلاوه بالا و پایین رفتن تولید سیتوکاین دقیقا با علائم کلینیکی مرتبط است .
( 7، صفحه 24 )
القاء سیتوکاینی در سطح سلولی :
مکانیسمهای القاء سیتوکاین بوسیله ویروس آنفولانزا هنوز کاملا روشن نشده است و هنوز جوابی برای سوالی همچون : آیا تولید سیتوکاین در سلولهای عفونی صورت می گیرد یا دیگر سلولها ؟
کدامیک از پروتئنها یا ژنهای ویروسی دخیل هستند ؟ آیا مکانیسمهای القاء برای سیتوکاین های مختلف متفاوت می باشد ؟
تعدادی مطالعات TNF- ,IFN_ in vitro داده های متضادی را نشان داده است . تعداد سیتوکاین قویاً وابسته به نوع سلول می باشد واستفاده از انواع مختلف سلول ممکن است توجیه کننده این مغایرتها در مطالعات in vitro باشد . تاکنون سلولهای تولید کننده سیتوکاین در in vitro طی بیماری آنفولانزا تعیین مشخصات نشده اند.
بنابراین ، ما منشا سلولی TNF- , IFN- در شش خوکهای عفونی شده را بررسی کردیم . ( 7 ، صفحه 24 )
شواهد بیشتر در مورد نقش سیتوکاین ها در آنفولانزا :
سیتوکاین ها بخشی از یک شبکه پیچیده هستند وتعیین نقش سیتوکاین های اختصاصی در in vitro مشکل می باشد ، دراینجا هم مطالعات آزمایشگاهی با استفادهاز راههای مختلف وانواع حیوانات نتایج متضادی را داد . این مطالعات میزان قابل توجه IL-1B,IL-1 , TNF- , IFN- در پاتوژنز آنفولانزا تایید کرد. لیکن ، اثر بلوک کردن سیتوکاین های اختصاصی فقط تا حدودی بود ودر تعدادی موارد خیلی خفیف بود . مطالعات در موش صحرائی به عبارت دیگر در پیدا کردن شواهدی برای نقش IL-1 . IL-6 , TNF- در القاء تب در آنفولانزا به نتیجه نرسید ( 7، صفحه 24 )
بررسی فاکتورهای TGF-B ومرگ سلولی در پاتوژنز ویروس Hong Kong /156در جوجه ها :
سویه های بیماریزای ویروس آنفولانزابطور شدید باعث خسارات اقتصادی به صنعت جهانی طیور می گردد. بسیاری از مطالعات دقیق مقایسه ای نشان می دهد که در سویه های انسانی ومرغی هنگ کنگی که شناسایی شده اند انتقال متقاطع گونه ای مستقیما با تغییرات ژنهای ویروسی مرتبط نمی باشد .
اگر چه اطلاعات زیادی در مورد ویروسهای آنفولانزا در دست می باشد ولی در مورد پاتوژنز ویروس هنوز داشته های ما خیلی کم می باشد .
مطالعات با استفاده از سویه بسیار پاتوژنA/Turkey/Ontario/7732/66cty/ont پیشنهاد می کنند که کم شدن لنفوسیتها که درجوجه ای عفونی مشاهده می شود یک نتیجه مستقیم آپوتوزیس می باشد . کارهای بیشتر نشان می دهد که TGF-B ، یک پروتئین بسیار حفاظت شده تنظیم کننده رشد ، مستقیما بوسیله ویروس آنفولانزا فعال می شود وآپوپتوزیس را القاء می کند .
افزایش فعالیت TGF-Bدر 8 ساعت بعد از عفونی کردن جوجه ها با TY/ont مشاهده شد . جالب است که ، جوجه هایی که با غلظت معادل از A/Mallard/Wisconsin یک سویه کم پاتوژن ، عفونی شدند افزایشی در فعالیت TGF-B را نشان ندادند وسطح آپوتوزیس خیلی پایین بود .
بحث :
در این مطالعات ما نشان دادیم که ویروس 156 هنگ کنگی ابتدا در اپیتلیوم دستگاه تنفس همانند سازی می کند و به دنبال آن به سرعت در بدن پخش می شود . افزایش آپوپتوزیس به نظر می رسد که درابتدای عفونت رخ می دهد وبا گذشت زمان افزایش
می یابد. بر خلاف دیگر سویه بسیار پاتوژن آنفولانزای مرغی ، HK156 قادر نیست که TGF-B را فعال کند . دلیل این مسئله نامعلوم است .( 7، صفحه 26)
پاسخ های ایمنی سلولی وهمورال خوک به یک عفونت با ویروس آنفولانزا یا بعد از واکسیناسیون خوکها بر علیه آنفولانزا بطور رایج بوسیله دو دفعه به روش داخل ماهیچه ای با استفاده از یک واکسن غیر فعال ویروس کامل ، حاوی آدجوانت صورت می گیرد . همچنین یک واکسن تیترهای بالای آنتی بادی IgG را در خون القاء می کند ومی تواند نقش حفاظتی در برابر بروز علائم بیماری داشته باشد . اما محافظت در برابر یک عفونت وسویه های مختلف از نظر آنتی ژنتیکی از تحت تیپهای مشابه هنوز بصورت سوال باقی مانده است . ما باور داریم که یک دستور کار واکسیناسیون که بیشتر یک پاسخ ایمنی ماهیچه ای و ایمنی سلولی را تحریک می کند . مصونیت بهتری بوجود می آورد . بنابراین ، ما شروع به مطالعه مقایسه ای بین پاسخ های ایمنی بعد از یک عفونت طبیعی و واکسیناسیون کردیم . ( 7، صفحه 26)
بحث :
نتایج دل بر یک ترشح فعال آنتی بادی های موضعی IgA در ششها واعضاء بویایی وترشح موضعی IgG1 در ششها پس از عفونت باویروس آنفولانزای مرغی
می باشد . این آنتی بادی های موکوسی می تواند ایمنی موضعی در برابر عفونت مجدد پدید آورد .
واکسیناسیون مرسوم با یک واکن حاوی ویروس کامل غیر فعال به همراه ادجوانت بطور عمده پاسخ ایمنی سیستمیک با تولید IgA را تحریک می کند که در برابرنومیا ایجاد مصونیت خواهد کرد. پیشرفت روش ایمنی زائی که تولید IgA موکوسی را تحریک می کند ممکن است یک واکسیناسیون کارآمد را فراهم سازد .
آنتی بادی های IgA اختصاصی برای ویروس آنفولانزا برای دوره کوتاهی پس از عفونت قابل جداسازی هستند . بنابراین ، الیزای IgA برای تشخیص عفونت اخیر ویروس آنفولانزا می تواند استفاده شود . ( 7، صفحه 27)

قسمت چهارم :
واکسیناسیون وآنتی ویروسها
هیدروکلرید آمانتادین ویکی از آنالوگهای آن ( ریمانتادین ) داروهای ضد ویروسی برای کاربرد سیستمیک برای جلوگیری از آنفولانزای A هستند . این داروها پوشش زدایی ( uncoating) ویروس آنفولانزای A را در سلول میزبان مهار می کنند. عمل ضد ویروسی عمده عبارت است از مسدود کردن کانال یونی فعال شده بوسیله اسید از طریق پروتئین M2 ویروسی . موتانتهای مقاوم به دارو ایجاد شده وپخش می گردند . آمانتادین نسبتاً غیر سمی است ولی ممکن است سبب تحریک سیستم عصبی مرکزی همراه با گیجی وبیخوابی خصوصاً درسالمندان گردد .
ریباویرین « یک آنالوگ نوکلئوزید صناعی » وانترفرون در موشها فعالیتهای ضد ویروسی بر علیه آنفولانزای A نشان داده اند ولی شواهدی از موثر بودن آنها در انسان در دست نمی باشد . تلاشهای منطقی برای طراحی دارو معطوف به مجموعه ترانس کریپتاز ویروسی است که یک روند اختصاصی ویروس بوده و به مهار کردن حساس می باشد . ( fields, vol.2)
در ایالت متحده ، واکسنهای ویروس آنفولانزا که بطور تجاری برای انسان ها ، اسبها وخوکها در دسترس هستند واکسنهای غیر فعال ویروس کامل یا تحت واحد می باشند . درحالی که این واکسنها ممکن است میزان مرگ ومیر وشدت بیماری را کاهش دهند اما آنها نمی توانند یک مصونیت پایدار در مقابل عفونت پدید آورند : درمقابل ، بهبودی از عفونت تجربی با ویروسهای آنفولانزا در حیوانات یک مصونیت پایدار را در برابر برخورد مجدد با عامل بیماری پدید می آورد . ما درصدد فهم اساس ایمونولوژیک این نوع مصونیت برآمدیم وسعی در ساخت واکسنهایی که در چنین سطحی بتوانند ایمنی زائی داشته باشند گردیم .
DNA واکسیناسیون شامل تجویز DNA پلاسمیدی است که یک ایمونوژن راکد
می کند که دراین مورد ایمونوژن مورد نظر ما HA ویروسهای آنفولانزا بوده و به تجویز ایمونوژن به صورت پروتئینی ارجحیت دارد . DNA را می توان به روشهای مختلف تجویز کرد ، شامل تزریق parenteral ، استفاده درموکوس ، تلقیح با تفنگ ژنی در اپیدرم . یکی از بزرگترین امتیازات این حقیقت است که آنی ژنها به صورت denovo « بدون الگو» در سلولهای عفونی شده ساخته می شوند وسپس می توانند هم به وسیله ملکوبهای MHCI وهم MCHI عرضه شوند وهمانطور که ایمنی همورال را تحریک می کند ایمنی سلولی را نیز تحریک کنند
فراتز از فراهم آوردن یک راه جدید به ایمنی زائی ، DNA واکسن همچنین یک ابزار قوی و مناسب برای تعدیل وفهم اساس پاسخهای ایمنی می باشد .
ما بر روی DNA واکسیناسیون برعلیه ویروسهای آنفولانزای مرغی وخوکی کار کردیم، با مطالعه بر روی موش شروع کردیم وسپس به اسب وخوکها منتقل کردیم
در تعدادی از آزمایشاتمان DNA ، HAوپلاسمید دومی را که IL-6 را به عنوان یک سیتوکاین ادجوانت کد می کرد تجویز کردیم . ( 7، صفحه 6)
بحث ونتایج :
آزمایشات اولیه مادر موش نشان داد که وکسن اسبی از نوع HAو DNA یک مصونیت نسبی پدید می آرورد . کارآیی واکسن به میزان قابل توجه ای بوسیله تاخیر در زدن دوز یادآور از 3 تا 9 هفته افزایش پیدا می کند . ( 90% موش های واکسینه شده کاملاً مصون شدند . ) این موضوع شامل دیگر DNA واکسنها هم می شد که با طولانی کردن زمان یادآوری مصونیت بالا می رود .
تجویز توام DNA ، IL-6 انسانی + پلاسمید HA اسبی یک مصونیت کامل در موش پدید می آورد ، بطوری که در ریه هیچ کدام از موشها هیچ ویروسی بعد از برخورد مجدد با ویروس قابل تشخیص نبود .
اضافه کردن IL-6 باعث افزایش آنتی بادی های اختصاصی ویروس درسرم ودر موکوس ( IgA ) ولی بطور غیر منتظره سطح IgA اختصاصی در ترشحات بینی افزایش پیدا کرد . نقش بالقوه IgA موکوسی در محافظت همچنین در مطالعات ما بر روی DNA واکسن در اسبها نیز مشخص شد . در یک مطالعه مقایسه ای DNA واکسیناسیون اسب در پوست + محلهای موکوسی « زبان وملتحمه » ، همینطور در موش ، مصونیت بر علیه ویروس با وجود IgA اختصاصی ویروس « IgGb » در ترشحات بینی وفقدان IgA قابل تشخیص همراه بود.
درمطالعات اولیه واکسیناسیون اسب بوسیله DNA ، HA + IL-6 « اسبی » حیوانات دوباره در حضور IgGb اختصاصی در سرم و ترشحات بینی مصون شدند اما درغیاب IgA در زمان برخورد مجدد باویروس .
هنوز ما از مطالعات گذشته می دانیم که بهبودی از عفونت تجربی با ویروس آنفولانزا در اسبها پاسخ های قوی IgA بینی را القاء می کند . پس ، به این موضوع مهم باید توجه داشت که احتمالاً DNA واکسنها به جای اینکه روند ایمنی زائی ساده ویروس را تقلید کنند از طریق مکانیسمهای منحصر به فردی ایجاد مصونیت می کنند .
در مطالعات اولیه بر روی خوکها ما یک دوز پایین از DNA واکسن را بکار بردیم . همانطور که در اسبها ، تجویز DNA از طریق سطوح موکوسی بهتر از واکسیناسیون در پوست بود اما حیوانات قبل از برخورد مجدد با ویروس هیچ تغییر سرمی را نشان ندادند و در مقابل ویروس ایمن نشدند .
اما جالب است که خوکها که بوسیله DNA واکسینه شدند بعد از برخورد مجدد پاسخهای قوی آنتی بادی HI را نشان دادند . پس ، یک راهی که ما بطور رایج
می توانیم برای مصون کردن خوکها بکار بریم تجویز DNA واکسن وسپس یادآوری آنها با یک واکسن پروتئینی مرسوم می باشد .
بعلاوه ، مطالعات با آزمایش دوزهای بالاتر وطرق مختلف واکسیناسیون DNA واکسن و بررسی پاسخهای ایمنی دنبال گردید . ( 7، صفحه 61 )
مصون سازی جوجه ها بوسیله ویروس آنفولانزای مرغی غیر فعال و واکسنهای نوترکیب آبله پرندگان از آنفولانزای بسیار بیماریزای H5 از جنبه تغییرات ژنتیکی در ویروسهای مزارع در طول سالها .
بطور مرسوم ، کنترل آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن « HPAI » از طریق تدابیر سرکوب کنندگی صورت می گیرد . استفاده از واکسن به برنامه های کنترلی در برابر آنفولانزای با بیماریزایی متوسط در مرغابی های Midwestern ایالت متحده محدود می شود واخیراً نیز بر علیه HPAI در پاکستان ومکزیک انجام می گیرد .
در USA ، سرویس حفاظت سلامتی گیاهان وحیوانات (APHIS ) یک استراتژی را برای کنترل HPAI در آینده تنظیم کرده است که می تواند شامل استفاده از واکسن دریک برنامه چند جانبه ریشه کنی می باشد .
در انسانها، واکسنهای تری والان غیر فعال برای کنترل وپیشگیری تیپهای A,B آنفولانزا مورد استفاده قرار می گیرند اما بدلیل تغییرات آنتی ژنتیکی ، واکسنها دارای عمر مفید محدودی هستند وترکیب آنها تصمیم گرفته شده که هر ساله تنظیم شود .
سیر مطالعات به این جهت کشیده شده که تعیین کنند آیا لازم است که واکسنهای برعلیه HPIV H5 بطور مکرر برای فراهم آوردن یک مصونیت کافی تغییر پیدا کند .
( 7، صفحه 62)
مواد روشها :
آزمایش 1- گروههای 10 تایی از جوجه های سفید Leghorn 4 هفته عاری از پاتوژن اختصاصی بطریقه زیر جلدی با هریک از 12 کاندید واکسنهای غیر فعال AI ، ایمن شدند . واکسنهایی که استفاده شدند شامل یک مایع تخم تلقیح نشده ، یک H7AIV ده H5AIV بودند . برخورد با ویروس 3 هفته بعد از واکسیناسیون ( PV ) بوسیله تلقیح داخل بینی ( IN) به میزان 7/7 10 ELD50 از ویروس HP Chick/Que/14588/95AIV صورت گرفت . نمونه سوآپ از دهان وگلو و کلوآک در زمان حداکثر ریزش ویروس گرفته شد ، 3 روز بعد از تلقیح ( PI ) ، برای جداسازی ویروس آن را در جنین 10 روزه تخم مرغ کشت دادیم . توالی آمینواسیدی مشهور HA1 برای واکسن و ویروسهایی که برخورد مجدد با آنها داشتند تعیین شد.
آزمایش 2-90 تا جوجه SPF WL یک روزه با یک واکسن حامل نوترکیب آبله پرندگان حاوی یک ژن HA اضافه شده از Turkey/Ireland/83(H5) « وکتور HA » ایمن شدند . 90 جوجه نیز با وکتور آبله پرندگان « وکتور کنترل » ایمن شدند .
در هفته سوم ، 10 تا از جوجه های ایمن شده با وکتور – HA و 10 تا از جوجه های ایمن شده با وکتور کنترل بصورت IN با 250 دوز کشنده جوجه از 1 تا HP AIV9 مختلف تلقیح شدند ( جدول 2 ) نمونه ها مشابه مانند بالا گرفته شدند .
نتایج :
آزمایش 1- قطعه HA1 از پروتئین HA از ویروسهای واکسن H5 دارای 100%- 8.96از آمینواسید های مشهور مشابه با HA1 از HP H5 AIV بودند . برای گروههای واکسن H5، بیشتر جوجه های ایمن شده فاقد علائم کلینیکی بودند و بعد از مواجه با HPAI H5 AIV زنده ماندند . ( جدول 1)
گروههای واکسن Sham ,H7 دارای 100% بیماری و و 90% مرگ ومیر بعد از مواجه با ویروس مشابه با گروههای بالا بودند . AIVدر 83% جوجه های با التهاب حفره گلو دهانی از 12 گروه در روز سوم PI جدا شد .
تیترAIV بدست آمده 305-103 10ELD50/ml از محیط کمتر برای واکسنهای H5 همانطور که با گروههای sham یا H7 مقایسه شد . AIV از کلوآک جوجه های ایمن شده با H5 کمتر جدا شد ( 20% ) وقتی که با گروههای ایمن شده با sham ,H7 (60%) مقایسه گردید . تیتر ویروس برای تمامی نمونه های کلوآک پایین بود . آزمایش 2- قطعات HA2,HA1 از پروتئین HA دارای 87.3-100%توالی آمینو اسیدی مشهور مشابه بین 9 برخورد مجدد AIV و ویروس واکسن وکتور – HA بود . واکسن نوترکیب آبله پرندگان H5 یک مصونیت کامل را در برابر مرگی که به دنبال برخورد با نه H5 HP AIV رخ می داد شدند . « جدول 2»
گروههای کنترل دارای ویروسهای جدا شده از اوروفارنیکس « 90% » و « 88% » کلوآک بودند. گروههای وکتور –HA حذف شدند یا به حداقل رسانده شدند ، AIV از کلوآک در 9 گروه واز اوروفارنیکس در تمام گروهها به جز chicken/Queretaro/14588/959 chicken/PA/1370/83 (7، صفحه 63)
بحث :
داده ها نشان می دهند که تغییرات مکرر واکسنهای H5 AI ممکن است برای پدید آوردن یک مصونیت کامل از بروز علائم کلینیکی ومرگ دراثر ویروسهای مزارع ضروری نباشد . ایمن زائی با این واکسنها باید ریزش AIV رااز اروفارینکس و کلوآک جوجه هایی که در معرض AIV قرار گرفته اند کم کند . لیکن ، ویروسهایی که دارای 90% همولوژی در HA با واکسن هستند و در معرض مجدد ویروس قرارمی گیرند ممکن است که در ریزش AIV از اوروفارنیکس کاهش نشان ندهند . ( 7، صفحه 64 )
محافظت از موش با زانامیویر و ریمانتادین بعد از عفونت در موشهای عفونی شده با ویروس A/Hong Kong/156/97( H5N1 ) با زانامیویر و ریمانتادین
مقدمه :
به دلیل اینکه ویروس بسیار پاتوژن A/Hong Kong /156/97(H5N1 ) دارای شیفت آنتی ژنی در آنتی ژنهای سطحی HA ,NA می باشد واکسنهایی که هنگام شیوع این ویروس استفاده شد قادر به مصون سازی نبود . آمانتادین وریمانتادین برعلیه عفونت ها و ویروسی آنفولانزا A موثر هستند . لیکن ، استفاده از این دارو ها بوسیله ظهور سریع موتانت های مقاوم به دارو و عوارض جانبی خود داروها محدود می گردد. یک داروی جدید ضد آنفولانزا، زانامیویر، نشان داده شده که برعلیه عفونت آنفولانزای A,B در موش ، موش صحرائی وانسانها موثر می باشد وبخوبی تحمل
می شود . لیکن ، علی رغم پتانسیل بالای زانامیویر بر علیه NA ویروسهای آنفولانزای بسیار پاتوژن در in vitro ، دارد قادر به محافظت جوجه ها برعلیه تعدادی از
سویه های طاعون پرندگان نمی باشد .
این مسئله برای تحقیق مهم می باشد که چگونه زانامیویر برعلیه این سویه بخصوص ویروس در سیستم پستانداران موثر می باشد . ( 7، صفحه 68)
بحث :
در این مطالعه ما عفونت آنفولانزای (H5N1) HK/97 را در مدل پستانداری وایجاد کردیم ونشان دادیم که تجویز داخل بینی zZanamivir وتجویز دهانی ریمانتادین باعث ایجاد محافظت در برابر عفونتهای کشنده می کند این موضوع بوسیله سه شاخص کنترل گردد:
کاهش در تیترهای ویروسی شش ، کاهش در بیماریزائی که از طریق کاهش وزن بررسی گردید ، وکاهش در مرگ و میر هم بطور مطلق از طریق تعدادآنهایی زنده اند وهم بوسیله کنترل زمان بین عفونت ومرگ بعنوان MSD یا میانگین طول روزهای عمر . این داده ها دلایل منطقی را برای مطالعات بعدی بر روی زانامیویر وداروهای وابسته در درمان ویروسهای آنفولانزای مرغی با قدرت عبور از سدهای بین گونه ها وبیماریزائی در پستانداران فراهم آورد .
لیکن باید به خاطر داشت که داده های گزارش شده در اینجا برای پیشگیری ودرمان بیماری ممکن است منعکس کننده غلبه این دارو درزمان تاخیر در درمان نباشد
( 7، صفحه 68)
ایمونوژنسیته گلیکوپروتئین های آنفولانزا با فرمهای مختلف سازماندهی سوپر ملکولی راهی که یک Ag به سیستم ایمنی عرضه می شود اغلب برای دستیابی به پاسخ ایمنی عملی تعیین کننده می باشد . نشان داده شده که یک Ag می تواند وقتی که در یک حالت مجتمع ، به فرم کلوئیدی برای مثال بعنوان مسیل پروتئین عرضه گردد بیشتر
آنتی ژنتیک می گردد.
گلیکوپروتئین های قابل حل Envelop ویروس آنفولانزا بر روی کمپلکس های ملکولی مختلف مانند مسیلها ، لیپوزمها و ISCOM ها از طریق بر هم کنش های هیدروفوبیک دمین ها انتقالی غشاء راحت تر سوار می شوند .
بنابراین تغییر فرم سوپرملکولی گلیکوپروتئین جدا شده یکی از راههای احتمالی برای افزایش ایمونوژنسیته می باشد .
هدف از این مطالعه تحقیق بر روی فعالیت ایمونوژنیک ساختمانهای آنتی ژنی مختلف ( میسل ها ، ISCOM ها ) تهیه شده از آنتی ژنهای گلیکوپروتئین ویروس آنفولانزا می باشد ( سویه A/FPV/Rostock/34 ) .( 7، صفحه 68)

بحث :
نتایج بدست آمده نشان می دهد که فرمهای مختلف ملکولی آنتی ژن سطوح مختلف ایمنی همورال را تحریک می سازد . ISCOM ها بهترین فرم تحریک کننده سیستم ایمنی از گلیکوپروتئین های خالص FPV است که سطح بالایی از ایمنی همورال را نسبت به میسل گلیکو پروتئین ها تحریک می سازد . ISCOM ها همچنین یک سطح بالایی از آنتی بادی ها را در زرده تخم مرغ تحریک می سازند.
تیتر آنتی بادی زرده تخم مرغ مرتبط با سطح آنتی بادی های سرم می باشد .
( 7، صفحه70)
کارآیی ریمانتادین در برابر آنفولانزای پرندگان :
آنفولانزای مرغی درفرم کلاسیک طاعونی ( FCP ) به ندرت پدید می آید . لیکن ، در تعدادی از کشورهای دنیا این عفونت بوسیله شیوعهای epizootic ظاهر می شود ، که توسط سویه های ویروس آنفولانزا از دیگر تحت تیپها ، که بوسیله بیماریزایی کم در مقایسه با ویروس FCP مشخص می شدند . بیماریهای تنفسی بویژه اپیزوتیک های آنفولانزا میان جوجه ها ، معمولاً با بیماریهای اپیدمیک در میان مردم همزمان می شد یا اینکه کمی بعد از آن رخ می داد . مکرراً این ویروسهای تغییر یافته آنفولانزا از جوجه های عفونی شده وپرندگان synanthropic که باعث بیماری در آنها می شود جدا شده اند وبا آنتی ژنهای واقعی برای انسان مشابهت داشت .
نتایج :
بعد از بکار بردن ریمانتادین در روزهای 5 تا7 درمان ، علائم کلینیکی آنفولانزا ناپدید گشت میزان تلفات پرندگان به میزان 3و8% کاهش پیدا کرد. تیتر آنتی بادی های اختصاصی در 5 و2% از سرمهای تست شده یافته شد ، درحالی که درگروه جوجه های درمان شده با اریترومایسین این درصد 21% می باشد . اثر درمانی ریمانتادین برعلیه آنفولانزای پرندگان 85و7% ساختگی می باشد .
بحث :
نتایج بدست آمده تاثیر بالای درمانی ریمانتادین را در طول درمان آنفولانزا در پرندگان در مقایسه با اریترومایسین تایید می کند . با استفادهاز روش اسپری کردن ریمانتادین میزان مورد استفاده کمتر می شود وقیمت تمام شده نیز کمتر می گردد و کارآیی نیز بالا می رود . (7 ، صفحه 71 )
شناسایی وتحت تیپ بندی ویروسهای آنفولانزای مرغی بوسیله RT-PCR :
ویروس آنفولانزای مرغی بوسیله RT-PCR با استفاده از یک سری پرایمرهای اختصاصی برای ژن نوکلئوپروتئین ( NP ) ویروس آنفولانزای مرغی صورت
می گیرد.
تحت تیپهای HA ویروس آنفولانزای مرغی بوسیله انجام همزمان 15 واکنش RT-PCR تعیین می گردد ، هر کدام با استفاده از یک سری پرایمر اختصاصی برای یک تحت تیپ HA برای یک سویه تنهای ویروس یا جدا شده ، فقط یکی از 15 واکنش RT-PCR محصولات با اندازه ای که انتظار داریم راتولید می کند و در نتیجه تحت تیپ HA ویروس آنفولانزا تعیین می گردد . نتیجه تحت تیپ HA سپس بوسیله بررسی توالی های محصولات PCR تایید می گردد. تمامی 80 سویه یاویروسهای آنفولانزای جدا شده بوسیله روش RT-PCR تحت تیپ بندی شدند ونتیجه RT-PCR یک انطباق عالی « 100% » با نتایج روش سرولوژیکی مرسوم داشت . این روش RT-PCR سری وحساس می باشد و می توان برای شناسایی وتعیین تحت تیپ HA ویروس آنفولانزای مرغی در ارگان هموژنه شده استفاده کرد . (9)


REFERENES :

1) Basic Information About Avian Influenza FACT SHEET , 2004.
2) Avian Influenza in Poultry1 UNIVERSITY of FLORIDA.
2) HIGHLY PATHOGENIC AVIAN…. Communicable Diseases network , 2004.
3) WHO interim guidelines on clinical ….2004.
4) Combined PCR – HeteroduPLex…
Jornal of Microbiology , 2001.
Neurovirulence in Mice of H5N1… ( 5
American Society fo Microbiology 2003.
6) INFLVENZA . A VIRUS ,H5N7 ,DUCKS – DENMARK , 2003
7) Symposium on Animal Influenza …..1999.
8) The evolution of H5N1 …. 2004.
9) Identification and subtyping of avian …